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基因敲出技术研究进展 (1)

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兰州交通大学化学与生物工程学院 综合能力训练Ⅰ——文献综述

题目：基因敲除技术研究进展

作者：蒋成 学号：201207749 指导教师：谢放

完成日期：2014-7-16 基因敲除技术的研究进展 摘要：本文综述了基因敲除技术的研究进展，对其基本步骤、基因敲除技术的种类及近几年来在真核生物与原核生物中的具体应用现状等进行了阐述，并通过列举实例阐明了该技术的作用和未来的发展前景，最后对该技术在应用过程中存在的一些问题做了简单总结。 关键字：基因敲除技术 原核中断系统 真核中断系统 丝状真菌基因敲除 1.引言 1.1概念 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础[1]。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[2]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2012年初的敲除决定表面抗原的猪的模型的成功建立更是为异种器官移植排除了一道重要的障碍，展示了基因敲除技术的美好前景。总之, 基因敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿，并已对生物学和医学的许多研究领域产生深刻的影响，成为革命性的研究工具, 具有极其重要的理论意义和实践意义[1,3]。

基因敲除是借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法，通过胚胎干细胞[2]这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏，揭示基因功能最直接的手段之一, 因此成为后基因组时代的重要研究方法和内容。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理[3]，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。 1.2基本步骤 （1）基因载体的构建：目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因，TK基因等）的载体上，成为重组载体。 （2）ES细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用，而最常用的鼠的种系是129 [4]及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。 （3）同源重组：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的 DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。 （4）选择筛选已击中的细胞：一般地，筛选使用正、负选择法，比如用 G418筛选所有能表达 neo 基因的细胞，然后淘汰所有 HSV -TK正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞。将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植人母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠[2,6]。 （5）表型研究：通过观察嵌体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。 （6）得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。

1.3基因敲出技术种类 1.3.1.条件性基因敲除法 条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法[4]。它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre干预的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态[3]。 1.3.2诱导性基因敲除法 诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。 1.3.3利用随机插入突变进行基因敲除 此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。 2.基因敲除技术的应用现状 2.1原核生物中基因敲除技术的应用 2.1.1基因敲除技术在丝状真菌中的研究现状 （1）载体构建利用PCR技术辅助构建打靶载体[7]可以快速获得目的片段，即大肠杆菌质粒基因。 （2）载体中加入特殊的结构元件或采用特殊的报告基因,在打靶载体中，加入非同重组选择标记是提高筛选效率的一种非常有效的方法. （3）构建高同源重组率茵株等将粗糙链孢霉中与KU70、KU80(编码与非同源重组有关蛋白质的基因)同源的两个基因分别敲除，突变株的生长及产生的孢子都正常，但对于一些抗真菌药物比野生型菌株更加敏感，对其进行基因打靶，转化子的同源重组率达100[5]，而对照的野生菌株只有109，6～309 [5]等确定了构巢曲霉中与人KU70基因同源的基因，将之敲除后，菌株的生长和敏感性几乎影响，但是同源重组率大幅度提高，90以上的转化子在正确的位点具有单拷贝插入。结合异源标记基因，建立了一个高效通用的构巢曲霉基因打靶系统。 （4）其他农杆菌的外源基因转化是目前植物转基因应用比较广泛的方法。1998年用农杆菌干预转化了等丝状真菌，并证明异源的农杆菌T—DNA往往以单拷贝随机地插入到丝状真菌染色体中近，以宿主对比研究了农杆菌介导转化法与CaCl／PEG原生质体转化法[4,7]。 2.1.2基因敲除技术在基因功能和结构方面的研究现状 作为研究基因功能和结构的最直接最有效的方法之一，为从分子水平研究病原菌致病、耐药机理，并为最终防治病害提供了强有力的手段。烟曲霉是曲霉属中最常见的致病真菌，在免疫受损的患者中常引起有致命危险的侵袭性肺曲霉病。等研究了烟曲霉erg3A和erg3B两个基因在固醇合成和对抗真菌药物耐受性中的作用。分别敲除rg3A基因[20]、erg3B基因和将两个基因共同敲除，结果显示erg3B编码C-5固醇脱氢酶，而erg3A对烟曲霉麦角固醇合成没有明显的作用，3种突变株对两性霉素B，等抗真菌药物的敏感性没有改变L4。构巢曲霉而被作为“模式”真核生物的一些丙酸盐可以作为丝状真菌的碳源，但是将它添加到含葡萄糖的培养基时又抑制真菌生长。为解释这一现象，人们对构巢曲霉进行了研究，发现了柠檬酸甲酯循环。Brock等进一步研究了这一机制，他们从构巢曲霉基因组序列中确定了上述循环中的一个关键酶——异柠檬甲酯酸裂合酶的编码基因，并将其敲除。得到的缺失株在以丙酸盐为碳源的培养基上不生长，在以其它物质为主要碳源且含有丙酸盐的培养基上受抑制。由此推论，柠檬酸甲酯循环的产物异柠檬甲酯是潜在的细胞代谢毒物。 2.1.3基因敲除技术在改良工业生产菌株中的应用现状 丝状真菌与其它生产菌株相比有其独特优点，即具有很高的蛋白质分泌能力；能正确进行各种翻译后加工，包括肽链剪切等，且其糖基化的方式与高等真核生物的类似；丝状真菌如曲霉等作为生产菌株，已有成熟的发酵和后处理工艺。但是丝状真菌用作工业生产菌株也存在一些缺陷，例如对外源蛋白质的表达量低，有的菌株会产生一些有害物质影响产品品质等。基因敲除技术无疑给基因工程育种提供了一个有效的途径。孙晶等以潮霉素抗性基因为标记，利用基因敲除技术将黑曲霉GICC2773中一种编码天冬氨酸胞外蛋白酶的基因敲除，功能分析显示突变株的酸性蛋白酶活性明显下降，外源蛋白漆酶的分泌表达提高，提示基因的缺失对外源蛋白漆酶的表达有保护作用。 2.1.4基因敲除技术次生代谢产物合成途径改造中的应用现状 丝状真菌的许多次生代谢产物对人类的营养和健康有着非常重要的作用，如抗生素、stat类药物、有机酸、多不饱和脂肪酸等。利用基因敲除技术可以有目的地对次生代谢产物生物合成途径进行改造，使代谢向目的产物积累方向进行。 2.1.5原核中断系统中的应用现状 Red系统的机制：Red系统是原核中断系统的代表,由λ噬菌体bet、gam3个基因组成,它们分别编码Gam3蛋白质。一种核酸外切酶,单亚基的分子量为24kDa,这种蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子,中间有一中空的通道,通道的一端可容纳双链DNA分子,另一端只可容纳单链DNA。Ex蛋白可结合在双链DNA的末端,从DNA双链的5′端向3′端降解DNA,产生3′突出端。Beta蛋白是一种退火蛋白,单亚基的分子量为25.8kDa。在溶液中,Beta蛋白自发地形成环状结构,紧紧地结合在单链DNA3′末端DNA被单链核酸酶降解, 同时干预互补单链DNA的退火双链DNA退火完成后,Beta蛋白从DNA双链上解离下来。Beta蛋白在Red同源重组过程中起着决定性的作且重组效率远高于重组 2.2真核生物中基因敲除技术的应用 将小鼠ESC中的卡巴B蛋白抑制因子的激酶2基因敲除[16],获得了杂合的IKK2突变体(IKK+/-2),杂合体在各个方面都是正常的, 通过杂合个体之间的交配, 研究者在很长时间内未能得到该位点纯合的个体,即 I KK- / -2 个体。在杂合状态时IKK2的表达只是受到了影响,但依旧有表达,而一旦纯合就意味着该基因的表达完全被中断,或者说即便有表达,表达出的蛋白质也不再是正常的IKK2。随后的研究表明，IKK-/-2属致死基因型,该位点纯合的个体在胚胎发育的早期(125~135d)死亡。原因是当无IKK2表达时，胎儿产生肿瘤坏死因子)引起早期胎儿的肝细胞发生大量凋亡，而在正常情况下，IKK2可抑制TNF引起的肝细胞凋亡。那么

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基因敲除技术

基因敲除技术

基因敲除技术gene knockoutgene knockout简介基因敲除技术是一种通过破坏特定基因来研究该基因在细胞或生物体中功能的实验方法。

这项技术在基础研究、疾病模型构建以及药物开发等领域中起着重要作用。

通过敲除特定基因，我们可以揭示该基因在生物体中的功能，对其与相关疾病的关联进行研究，并探索其在生物学过程中的作用机制。

基因敲除技术的原理基因敲除技术是通过引入特定的DNA片段使目标基因发生突变或被删除，从而破坏目标基因的功能。

常用的基因敲除技术包括CRISPR/Cas9、转座子、RNA干扰等。

CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9是目前应用最广泛的基因敲除技术之一。

它基于细菌和古菌的天然免疫系统中的一种防御机制。

CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种由短重复序列和变异序列组成的DNA片段。

Cas9是一种具有核酸内切活性的酶。

CRISPR/Cas9技术利用RNA导向的Cas9酶靶向识别和切割特定的DNA序列。

在细胞中引入含有目标基因的RNA分子和Cas9酶后，Cas9酶会与RNA分子结合形成复合物，通过RNA分子的导向，使Cas9酶与目标基因特异性结合，并切割目标基因的DNA序列，导致基因发生突变或敲除。

转座子转座子是一种能在基因组中移动的DNA片段。

转座子可以在基因组中发生插入、删除或重排等事件，从而导致基因的敲除和突变。

转座子技术通过引入含有转座子序列的DNA片段来实现基因敲除。

在细胞中，转座子序列会与基因组发生重组，导致目标基因的敲除或突变。

RNA干扰RNA干扰是一种通过介导靶向特定mRNA分解的机制来抑制基因表达的方法。

在RNA干扰中，特定的siRNA（small interfering RNA）或shRNA（short hairpin RNA）分子与目标mRNA相互作用，导致mRNA的降解，从而抑制特定基因的表达。

大肠杆菌CRISPR-Cas9系统基因敲除简介

大肠杆菌CRISPR-Cas9系统基因敲除简介

1CRISPR-Cas系统的研究进展CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，即串联的、间隔的短回文重复序列，最早在1987年研究大肠杆菌的碱性磷酸酶基因时被发现[1]。

随后在细菌和古细菌的基因组中也发现大量存在CRISPR，研究证实它能够保护自身抵御外来病毒和质粒的入侵[2]，作用机制是依靠crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)结合并引导Cas蛋白对外源DNA进行特异性降解[3]。

已发现的CRISPR-Cas系统有三种类型：Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型，其中以Ⅱ型最为简单，只需一种Cas蛋白，即通过RNA 介导核心蛋白Cas9识别并切割靶序列，引起DNA双链断裂[2]。

受自然界中CRISPR-Cas系统的启发，主要对来自于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Ⅱ型CRISPR-Cas系统进行人为改造和利用，目前已经将其发展成为一种新型的基因编辑技术，实现基因敲除、插入、定点突变和组合编辑[4]，并成功应用于大肠杆菌、酿酒酵母、家蚕、果蝇和人类细胞等[5]。

和传统的基因编辑技术相比，这一新技术具有成本低、操作简便、效率高的优点[6]。

2 CRISPR-Cas系统的组成与机制典型的Ⅱ型CRISPR-Cas系统基因座包含tracrRNA基因、Cas蛋白编码基因(cas9、cas1、cas2和csn2)、CRISPR基因座（引导序列、间隔序列和重复序列）这三个部分[6]。

Ⅱ型CRISPR-Cas系统的作用机制可分为三个阶段，第一是高度可变间隔序列的获得（图1），第二是CRISPR-Cas系统基因座的表达，第三是对外源遗传物质的降解[6]（图2）。

Cas1、Cas2和Csn2蛋白与新间隔序列的获得相关。

与间隔序列同源的外源遗传物质上的原间隔序列(protospacer)，其下游存在一段保守序列，被称为PAM(protospacer adjacent motifs)[7]。

遗传学中的基因敲除技术

遗传学中的基因敲除技术

遗传学中的基因敲除技术随着遗传学研究的不断深入，基因敲除技术的出现为研究基因和基因功能提供了更好的手段。

基因敲除技术是指通过遗传工程手段，使特定细胞或个体中的某一基因或基因组不表达或失去功能的技术。

它可以帮助我们更深入地了解基因的功能，揭秘疾病的发生机制以及探究生物的生命活动中所涉及到的遗传机制等方面。

基因敲除技术的分类目前基因敲除技术主要有两种：一种是RNA干扰技术，另一种则是CRISPR/Cas9技术。

RNA干扰技术：如今已成为非常成熟的分子遗传学方法之一。

该技术通过小分子RNA或 hairpin RNA影响特定基因的表达，从而对细胞、组织、个体进行基因敲除。

它的原理是通过特殊的酶来切割RNA并将其降解，从而抑制RNA转录，进而实现基因敲除。

这种方法的优点是适用性广泛，不需要对宿主细胞进行基因改造。

CRISPR/Cas9技术：CRISPR/Cas9技术是指利用CRISPR介导的Cas9核酸酶来靶向切割和编辑基因组DNA的新型基因编辑技术。

该技术以高效、便捷、准确、可控为特点。

CRISPR/Cas9技术还可以将新DNA序列导入基因组，从而实现基因敲入。

CRISPR/Cas9技术引起了生命科学界的轰动，成为近年来研究基因组编辑技术的当红炸子鸡。

基因敲除技术在研究中的应用基因敲除技术的出现极大地促进了生命科学的发展。

它已经被广泛应用于研究基因组和基因功能，具体应用如下：1.揭示基因的功能：通过敲除某一基因，可以观察该基因对生命活动的贡献，从而深入了解其功能。

2.探究疾病的发生机制：某些疾病与特定基因的异常有直接关系，而基因敲除技术可以控制某些基因是否表达，从而更好地探究疾病的发生机制。

3.开发新药：基因敲除技术可以通过创建动物模型，在其中敲除某些基因，观察其对药物治疗效果的影响，从而开发新药。

4.精准基因治疗：基因敲除技术可以将健康基因导入染色体中进行修复，从而达到治疗疾病的效果。

5.研究基因联锁和遗传图谱：利用基因敲除技术，可以拆分遗传联锁，以便更好地理解和研究基因群之间的相互作用。

基因敲除技术在细胞功能研究中的应用

基因敲除技术在细胞功能研究中的应用

基因敲除技术在细胞功能研究中的应用生命科学是一个跨学科的领域，其中涉及了生物学、化学、医学等学科的知识。

其中，基因敲除技术是生命科学领域中的重要技术之一。

通过对细胞中的某个基因进行敲除，可以观察到该基因在细胞中所扮演的角色以及对细胞功能的影响。

在本文中，将深入探讨基因敲除技术在细胞功能研究中的应用。

一. 基因敲除技术的基本原理基因敲除技术首先要了解的是CRISPR/Cas9系统，它是一种分子生物学技术，可以精准地切除特定的DNA序列。

这个系统主要由两部分组成：CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）和Cas9（CRISPR-associated protein 9）。

CRISPR是由一系列基因组成的微小重复序列，这些序列中间间隔着一些维持不变的“桥梁”序列。

而Cas9就是一个酶，能够在特定的DNA序列上切割，从而实现基因敲除。

二. 基因敲除技术的应用1. 确认基因在生物学中的功能基因敲除技术可以用来对细胞中的激素、受体和信号途径进行研究，从而了解它们在细胞功能中的作用。

比如说，在之前的实验中，研究者使用基因敲除技术，查明了人类细胞生长激素有助于肝脏对葡萄糖的代谢，同时也可以增强胰岛素对于葡萄糖的抑制作用。

这种技术也可以用于研究每个基因与各自相关的特定表型，并建立基因组愈创木模型。

2. 揭示基因和癌症的关系基因敲除技术能够在癌症方面发挥大量的作用，这是因为在癌症中，信号通路的异常会导致细胞增殖及不断分裂。

因此，通过人工干涉这种信号通路的特定基因，就可以寻找并验证与癌症治疗相关的新靶标。

这种技术在小鼠中研究和测试，能够帮助研究者揭示癌症生长的细节。

3. 发现新的治疗方式基因敲除技术已被广泛用于基因治疗及基因编辑。

通过精确地引导Cas9蛋白，可以破坏患者特定基因上的变异位点，然后通过携带更多的正常基因来替换它。