第四章 叶绿素荧光技术应用
第一节 叶绿素荧光参数及其意义
韩志国，吕中贤（泽泉开放实验室，上海泽泉科技有限公司，上海，200333）
叶绿素荧光技术作为光合作用的经典测量方法，已经成为藻类生理生态研究领域功能最强大、使用最广泛的技术之一。由于常温常压下叶绿素荧光主要来源于光系统 II 的叶绿素 a，而光系统 II 处于整个光合作用过程的最上游，因此包括光反应和暗反应在内的多数光合过程的变化都会反馈给光系统 II，进而引起叶绿素 a 荧光的变化，也就是说几乎所有光合作用过程的变化都可通过叶绿素荧光反映出来。与其它测量方法相比，叶绿素荧光技术还具有不需破碎细胞、简便、快捷、可靠等特性，因此在国际上得到了广泛的应用。
1 叶绿素荧光的来源
藻细胞内的叶绿素分子既可以直接捕获光能，也可以间接获取其它捕光色素（如类胡萝卜素）传递来的能量。叶绿素分子得到能量后，会从基态（低能态）跃迁到激发态（高能态）。根据吸收的能量多少，叶绿素分子可以跃迁到不同能级的激发态。若叶绿素分子吸收蓝光，则跃迁到较高激发态；若叶绿素分析吸收红光，则跃迁到最低激发态。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定，会在几百飞秒（fs，1
fs=10－15 s）内通过振动弛豫向周围环境辐射热量，回到最低激发态（图 1）。而最低激发态的叶绿素分子可以稳定存在几纳秒（ns，1 ns=10－9 s）。 A 较高激发态 B
热耗散
吸收蓝光 吸收红光
最低激发态
能量
荧光
基态
蓝
波长
红
荧光
图 1 叶绿素吸收光能后能级变化（A）和对应的吸收光谱（B）（引自韩博平 et al., 2003）
处于最低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径（图 2）释放能量回到基态(韩博平 et al., 2003;
Schreiber, 2004)：1）将能量在一系列叶绿素分子之间传递，最后传递给反应中心叶绿素 a，用于进行光化学反应；2）以热的形式将能量耗散掉，即非辐射能量耗散（热耗散）；3）放出荧光。这三个途径相互竞争、此消彼长，往往是具有最大速率的途径处于支配地位。一般而言，叶绿素荧光发生在纳秒级，而光化学反应发射在皮秒级（ps，1 ps=10－12 s），因此在正常生理状态下（室温下），捕光色素吸收的能量主要用于进行光化学反应，荧光只占约 3%～5%(Krause and Weis, 1991; 林世青 et al., 1992)。 在活体细胞内，由于激发能从叶绿素 b 到叶绿素 a 的传递几乎达到 100％的效率，因此基本检测不到叶绿素 b 荧光。在常温常压下，光系统 I 的叶绿素 a 发出的荧光很弱，基本可以忽略不计，对光系统 I 叶绿素 a 荧光的研究要在 77 K 的低温下进行。因此，当我们谈到活体叶绿素荧光时，其实指的是来自光系统 II 的叶绿素 a 发出的荧光。
叶绿素荧光分析方法
叶绿素荧光分析具有观测手续简便,获得结果迅速,反应灵敏,可以定量,对植物无破坏、少干扰的特点。它既可以用于叶绿体、叶片,也可以遥感用于群体、群落。它既是室内光合基础研究的先进工具,也是室外自然条件下诊断植物体内光合机构运转状况、分析植物对逆境响应机理的重要方法。现在人们可以通过叶绿素荧光分析估计量子效率、光合能力,利用荧光参数计算光合电子传递速率、胞间CO2浓度,并且试图利用荧光参数快速筛选遗传变异的植物。有人甚至预言,将来荧光分析可能会代替气体交换测定。20世纪80年代以来,调制荧光仪,特别是便携式荧光仪的商品化,使荧光分析在光合作用研究中得到这样广泛的应用,以至如果不懂荧光分析技术,便很难看懂近年的光合作用研究文献。
1.基本原理
光合机构吸收的光能有三个可能的去向：一是用于推动光化学反应,引起反应中心的电荷分离及后来的电子传递和光合磷酸化,形成用于固定、还原二氧化碳的同化力(ATP和NADPH)；二是转变成热散失；三是以荧光的形式发射出来。由于这三者之间存在此消彼长的相互竞争关系,所以可以通过荧光的变化探测光合作用的变化(图4-1)。实际上,以荧光形式发射出来的光能在数量上是很少的,还不到吸收的总光能的3%。在很弱的光下,光合机构吸收的光能大约97%被用于光化学反应,2.5%被转变成热散失,0.5%被变成红色(在体内,叶绿京的荧光发射峰在685nm左右)的荧光发射出来；在很强的光下,当全部PSII反应中心关闭时,吸收的光能95%～97%被变成热,而2.5%～5.0%被变成荧光发射[l]。在体内,由于吸收的光能多被用于光合作用,叶绿素a荧光的量子产额(即量子效率)仅仅为0.03～0.06。但是,在体外,由于吸收的光能不能
图4-1叶绿素分子的光激发
被用于光合作用,这一产额增加到0.25～0.30[2]。在室温条件下,绝大部分荧光来自PS II天线[1,3],而不是反应中心的叶绿素a分子[4,5]。这是因为反应中心的叶绿素分子仅占叶绿素总量的几百分之一。叶绿素荧光发射的高峰在685nm(天线色素)和695nm(反应中心)。在体内,决定荧光产额的主要因素是电子的第一个稳定的醌受体QA的氧化还原状态。实际上,在暗适应的健康叶片和良好的叶绿体,所有的QA都处于还原态时的最大荧光产额与所有的QA都处于氧化态时的最小荧光产额之比大致为5~6[6]。然而,这个比值可以发生很大变化,取决于照光状态和一些处理。多种因素影响荧光强度：激发光强,反应中心对激发能的捕获和转化速率,激发能以热的形式耗散的程度和两个光系统间能量的分配等。当PS II的光化学反应被阻止时,最大荧光产额的减少是反应中心和天线热耗散增加的反映。由于可以测定完整叶片的荧光,叶绿素a荧光诱导动力学可以成为原位检测PS II重要步骤的极好的探针[5]。
植物日光诱导叶绿素荧光的遥感原理及研究进展
一、本文概述
植物叶绿素荧光作为一种非侵入性的生物光学现象，已经成为遥感科学领域的研究热点。叶绿素荧光主要来源于植物在吸收阳光能量后，经过一系列光化学反应产生的能量释放。这一过程不仅能够反映植物的光合作用活性，还能提供关于植物生理状态、环境胁迫和生态系统功能的重要信息。本文旨在深入探讨植物日光诱导叶绿素荧光的遥感原理，总结并分析近年来该领域的研究进展，以期为叶绿素荧光遥感技术的发展和应用提供理论支撑和实践指导。
文章首先将对植物叶绿素荧光的产生机制进行详细阐述，包括其光化学过程和影响因素。在此基础上，进一步介绍叶绿素荧光遥感的基本原理和技术方法，包括荧光信号的获取、传输和处理等关键环节。接着，文章将重点综述近年来植物叶绿素荧光遥感在生态系统监测、环境胁迫评估、作物生理状态诊断等方面的应用实例和研究成果。文章还将对叶绿素荧光遥感面临的挑战和未来发展趋势进行探讨，以期为相关领域的研究者和技术人员提供有益的参考和启示。
二、植物叶绿素荧光的产生机制
植物叶绿素荧光，作为一种光化学反应的产物，其产生机制涉及到光合作用过程中的能量转换和光保护机制。叶绿素作为植物光合作用的核心色素，主要吸收光能并将其转换为化学能，驱动植物的生长和发育。然而，当植物吸收的光能超过其光合作用系统所能利用的范围时，就会发生光抑制现象，导致叶绿素荧光的产生。
在光合作用的光反应阶段，植物通过叶绿素吸收光能，将水分解为氧气和电子，同时生成高能磷酸键，为暗反应提供能量。然而，当光能过剩时，叶绿体内的反应中心会受到损伤，导致电子传递链受阻，从而产生荧光。这种荧光是叶绿素分子在受到激发后，从高能级向低能级跃迁时释放的能量。
叶绿素荧光的产生与植物的光保护机制密切相关。为了应对光能过剩带来的压力，植物会启动一系列光保护策略，包括非光化学猝灭（NPQ）和光呼吸等。非光化学猝灭是一种通过热能形式耗散过剩光能的机制，而光呼吸则是在光合作用暗反应阶段通过消耗氧气和还原力来减轻光抑制。这些光保护机制在降低叶绿素荧光产生的同时，也保护了植物光合作用系统的稳定性和效率。
叶绿素的荧光和磷光
叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色，这种现象称为叶绿素荧光现象。
当叶绿素分子吸收光量子后，就由最稳定的、能量的最低状态－基态（ground state）上升到不稳定的高能状态－激发态（excited
state）。叶绿素分子有红光和蓝光两个最强吸收区。如果叶绿素分子被蓝光激发，电子跃迁到能量较高的第二单线态；如果被红光激发，电子跃迁到能量较低的第一单线态。处于单线态的电子，其自旋方向保持原来状态，如果电子在激发或退激过程中自旋方向发生变化，该电子就进入能级较单线态低的三线态。由于激发态不稳定，迅速向较低能级转变，能量有的以热的形式释放，有的以光的形式消耗。
chl + hr ──→chl* 从第一单线态回到基态所发射的光就称为荧光。处在第一三线态的叶绿素分子回到基态时所发出的光为磷光。荧光的寿命很短，只有10-8～10-10s。由于叶绿素分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部的振动上，发射出的荧光的波长总是比被吸收的波长要长一些。所以叶绿素溶液在入射光下呈绿色，而在反射光下呈红色。在叶片或叶绿体中发射荧光很弱，肉眼难以观测出来，耗能很少，一般不超过吸收能量的5％，因为大部分能量用于光合作用。色素溶液则不同，由于溶液中缺少能量受体或电子受体，在照光时色素会发射很强的荧光。
另外，吸收蓝光后处于第二单线态的叶绿素分子，其贮存的能量虽远大于吸收红光处于第一单线态的状态，但超过的部分对光合作用是无用的，在极短的时间内叶绿素分子要从第二单线态返回第一单线态，多余的能量也是以热的形式耗散。因此，蓝光对光合作用而言，在能量利用率上不如红光高。
叶绿素的荧光和磷光现象都说明叶绿素能被光所激发，而叶绿素分子的激发是将光能转变为化学能的第一步。现在，人们用叶绿素荧光仪能精确测量叶片发出的荧光，而荧光的变化可以反映光合机构的状况，因此，叶绿素荧光被称为光合作用的探针。
