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反相液相色谱法用于结合型胆汁酸选择性变化规律的研究

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研究报告反相液相色谱法用于结合型胆汁酸选择性变化规律的研究陈农张玉奎卢佩章（中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心，大连，１１６０１２提要］在反相液相色谱保留值基本方程ｌｏｇｋ＇＝＋玞ｃＣｂ的基础上，本文从理论和实验上证明了甘氨型和牛磺型结合胆汁酸的参数ｃ之间分别存在很好的线性关系，且相互平行。这种平行的ｃ线性关系表明：在给定的冲洗剂浓度下，甘氨和牛磺型给合型胆汁酸的选择性因子为不随保留值变化的常数，甘氨型和牛磺型胆汁酸的参数ｃ或之间的差值ｃ或为常数，每对甘氨型和牛磺型胆汁酸的ｌｏｇｋ＇与Ｃｂ的线性关系都相交在同一点上。人体液中胆汁酸水平的异常能灵敏地反映出消化系统的病变。在肝脏中，游离型初级胆汁酸、甘氨酸和牛磺酸相结合能形成结合型胆汁酸。对游离型和结合型胆汁酸的测定，对于肝、胆疾病的诊断及治疗具有重要的价值。反相液相色谱技术广泛应用于人体液中的胆汁酸的分离及分析［－６］，具有简单、快速、灵敏度高等特点。本文在反相液相色谱保留值基本方程的基础上，探讨结合型胆汁酸的选择性变化规律，并同时讨论了采用这种选择性变化规律进行结合型胆汁酸保留值预测的可能性。实验部分（一）试剂所用结合型胆汁酸甘氨脱氧熊胆酸（ＧＵＤＣ）、牛磺脱氧熊胆酸（ＴＵＤＣ）、甘氨胆酸（ＧＣ）、牛磺胆酸（ＴＣ、甘氨脱氧鹅胆酸ＧＣＤＣ、牛磺脱氧鹅胆酸（ＴＣＤＣ）、甘氨脱氧胆酸（ＧＤＣ）、牛磺脱氧胆酸（ＴＤＣ）、甘氨石胆酸（ＧＬＣ）、牛磺石胆酸（ＴＬＣ）等标准样品均为Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇ公司产品，甲醇为分析纯，水为二次蒸馏水，其它试剂均为分析纯。（二）色谱条件采用岛津ＬＣ－９Ａ泵，流速设为１．０ｍｌ／ｍｉｎ，色谱柱为Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ－ＯＤＳ，尺寸为２５０ｍｍ４．６ｍｍ　ｉ．ｄ．，柱子由国家色谱研究分析中心装填，采用日本分光公司ＵＶＩＤＥＣ－１００－型紫外检测器（２１０ｎｍ），进样采用Ｒｈｅｏｄｙｎｅ　７０１０型进样阀，实验在室温下进行。（三）实验方法流动相采用一定体积的甲醇与磷酸缓冲液混合而成，冲洗剂ｐＨ调至５．５０，实验中不断改变冲洗剂中甲醇的体积百分浓度（从６５％—８０％）。结果与讨论反相液相色谱溶质的保留值与冲洗剂浓度之间的关系可用式（１的简单线性关系来描述ｌｏｇｋ＝ａ＋ｃＣｂ　（１）式中ｋ＇为溶质的容量因子，Ｃｂ为冲洗剂中有机改性剂的体积百分浓度，参数、ｃ为常数，其中ｃ为作用指数，表明在一定柱温下溶质与冲洗剂的作用能不随所用Ｃ１８柱的变化而变化［８－９］。参数、ｃ都是溶质分子结构参数的函数。表１显示了十种常见的结合型胆汁酸在不同甲醇冲洗剂浓度下的ｋ值。表２显示了按式（１进行线性回归所得各胆汁酸的、󰀀ｃ值及回归系数。由表可见：结合型胆汁酸的保留行为主要由疏水作用所控制，这与式（１）所描述的线性变化规律相吻合。图１显示出三对结合型胆汁酸的ｌｏｇｋ与Ｃｂ的线性关系。表１ 十

种常见结合型胆汁酸在不同甲醇浓度下的ｋ＇值式（１）中参数、ｃ与溶质分子的结构参数有关［７。当分子相互作用不发生构型变化时，具有分子结构参数相差为常数的物质对，其参数或ｃ的差别为常数。而甘氨型和牛磺型胆汁酸分子结构主要在于（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈ及（ＣＨ２）ＣＯＯＨ基团上的差别（参见图２所以，甘氨型和牛磺型徒结合胆汁酸物质对之间的及ｃ应为常数。表２的数据证明了我们理论上的推论。这种现象反映在ｌｏｇｋ与Ｃｂ的图上则为：每对甘氨及牛磺型胆汁酸的ｌｏｇｋ＇与Ｃｂ直线都交于一点，而且五对结合型胆汁酸几乎都在横坐标的同一位置上相交（图１中只画出三对）。

另一方面，具有与极性作用能和氢键作用能相似结构的相关组分的参数ｃ及之间也有很好的线性关系［８］，而且在组分作用不发生构型变化的情况下，各类组分ｃ－线性关系为平行线［８］表２十种结合型胆汁酸的参数、󰀀ｃ值以及甘氨型和牛磺型结合型胆汁酸之间的和值＊ｃ＝ｌ・＋ｌ２　（２）式中ｌ１，ｌ２为常数。从分子结构分析可以看出：结合型胆汁酸分为两类结构的相关组分一类为甘氨型，一类为牛磺型；对于甘氨型和牛磺型结合胆汁酸应分别存在相互平行的ｃ线性关系。图３验证了我们理论预测的正确性。从以上的分析可以得出：在给定的冲洗剂浓度下，甘氨型和牛磺型胆汁酸的选择性因子为常数，我们将此选择性称为结合型选择性，并定义为：ｌｏｇ＝＋・Ｃｂ　（３）式中、ⅰ分别为甘氨胆汁酸和牛磺胆汁酸的参数及ｃ的差值。不难看出，Ｃｂ恒定时，甘氨型和牛磺型结合胆汁酸的值为不随保留值变化的常数＼．表３、表４的结果验证了我们理论上预测的正确性。

结合型胆汁酸的这种选择性变化规律对于实现结合型胆汁酸保留值预测和定性具有十分重大的意义。由于结合型选择性因子为常数，因此在甘氨结合型胆汁酸保留行为的基础上，采用结合型选择性因子就可以预测牛磺结合型胆汁酸的保留值，从而达到定性的目的。表４列出采用结合型选择性变化规律对甘氨型胆汁酸定性的结果，Ｋ预测的相对偏差小于５％，完全可以用于定性。在临床中，它为结

合型胆汁酸组分的快速定性打下基础。表３不同反相色谱体系中，甘氨型和牛磺型胆汁酸的Ｋ＇ⅵ值

表４不同反相色谱柱上结合型胆汁酸的ｋ＇值以及对甘氨胆汁酸的定性结果＊

参考文献［１］　Ｊ．Ｍ．Ｓｔｒｅｅｔ，Ｋ．Ｄ．Ｒ．Ｓｅｔｃｈｅｌ，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２，２２９（１９８９）．［２］　Ｓ．Ｓｃａｌｉａ，Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１０，２０５５（１９８７）．［３］　Ｐ．Ｓ．Ｔｉｅｔｚ　ｅｔ ｌ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３３６，２４９（１９８４）．［４］ ．Ｄ．Ｒｅｉｄ，Ｐ．Ｒ．Ｂａｋｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，２４７，１４９（１９８２）．［张玉奎等，第五次全国色谱报告会文集上虾海Ｐ．４１４，１９８７．［６］　邹汉法，博士学位论文，中国科学院大连化学物理研究所，１９８９．［７］　陈农，博士学位论文，中国科学院大连化学物理研究所，１９９１．［８陈农、卢佩章、张玉窨奎，中国科学Ｂ辑２，１３５（１９９２）．［９陈农、张玉奎、李玉珊、卢佩章，色谱６，３２５（１９８８）．［１０］　陈农、张玉奎、卢佩章，科学通报，３６，１０７３９９１）．［１１］　Ｎ．Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｋ．Ｚｈａｎｇ，Ｐ．Ｃ．Ｌｕ．Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１５，１５２３９９２）．［１２］　陈农、张玉奎、⒙卢󰀀佩章、分析测试通报８，２２（１９８９）．（收稿日期：１９９１年１２月２５日，修回日期：１９９２年５月３日）Ｔｈｅ　Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｇｌｙｃｉｎｅ　ａｎｄ　ＴａｕｒｉｎｅＣｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ｒｉｌｅ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅｄ－Ｐｈａｓｅ　ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｃｈｅｎ　Ｎｏｎｇ，Ｚｈａｎｇ　Ｙｕｋｕｉ　ａｎｄ　

ＬｕＰｅｉｃｈａｎｇ，Ｄａｌｉａｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈｙｓｉｃｓ，ＡｃａｄｅｍｉＳｉｎｉｃａ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｒ．＆Ａ．Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄａｌｉｎ，１１６０１２Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ　ｌｏｇ　ｋ＇＝ａ＋ｃＣｂ，ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｇｌｙｃｉｎｅ　ａｎｄ　ｔａｕｒｉｎｅ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｂｉｌｅ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ，ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｉｓｄｅｓｃｒｉｂｅｄ．Ｔｈｅ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐａｒａｍｅｔｅｒ　ｃｏｎ　ａ　ｆｏｒｇｌｙｃｉｎｅ　ａｎｄ　ｔａｕｒｉｎｅ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｈａｖｅ　ｒｅｓｕｌｔｅｄ　ｉｎ　ｔｗｏｐａｒａｌｌｅｌ　ｌｉｎｅｓ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　ｐａｒａｍｅｔｅｒ　ａ　ｏｒ　ｃ　ｂｅ－ｔｗｅｅｎ　ｇｌｙｃｉｎｅ　ａｎｄ　ｔａｕｒｉｎｅ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｆｏｕｎｄｔｏ　ｂｅ　ａ　ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｗｈｉｃｈ　ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎ－ｓｔａｎｔ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｇｌｙｃｉｎｅ　ａｎｄ　ｔａｕｒｉｎｅ　ｃｏｎｊｕ－ｇａｔｅｓ．Ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｌｏｇ　ｋ＇　ａｎｄ　Ｃｂｃｒｏｓｓ　ｅａｃｈ　ｏｔｈｅｒ　ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｐｏｉｎｔ　ｆｏｒ　ｅａｃｈ　ｐａｉｒ　ｏｆ　ｔｈｅｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．

根据双载气串联毛细管气相色谱系统压力操作参数进行定性分析王安＊　孙毓庆（天津药物研究院３０００９０（沈阳药学院，１１００１５）〔提要〕在ＨＰ－５８９０型气相色谱仪改装成单炉双载气串联毛细管气相色谱系统上，根据操作参数ＰｉＰａ和Ｐｏ求算死时间、相对滞留因子和系统容量因子，建立ｋｓ－２回归方程，进行定性分析。对酯类、酮类及醇类不同类型化合物定性分析结果与单柱实测值进行比较，在ＯＶ－１和ＰＥＧ－２０Ｍ柱上最大误差分别是２和５个Ｋｏｖａｔｓ指数单位。在双载气串联气相色谱系统中，改变固定液、柱温［２－５］和载气流速［２－３，６－８］对物质保留指数影响均十分显著。改变单炉双载气串联气相色谱系统两柱中载气流速对选择性的影响要比改变温度更为显著［９－１０］。改变双载气串联毛细管气相色谱系统相对滞留因子可改变色谱系统极性，于是色谱系统选择性有显著的和规律的变化。双载气串联气相色谱系统极性的连续可调性，为分离分析复杂混合物提供了有效的方法。但是，如何把物质在双载气串联气相色谱系统与在单柱气相色谱系统上的保留行为定量地联系起来，是解决双载气串联气相色谱系统定性分析的关键。理论依据载气流过色谱柱的死时间与柱子的进出口压力差值之间存在下列定量关系［１１］式中，为载气的粘滞系数，Ｌ为色谱柱柱长，ｒ为色谱柱内半径，Ｐ１为柱前压，Ｐｏ为柱子出口处压力。通过实验精确测定三组分正构烷烃混合物在ｍ组不同柱前压下的保留时间ｔＲ，利用下式计算死时间（式中，ｔＲ和Ｒ＋１分别是碳数为１ｎ和ｎ＋１的正构烷烃的保留时间。经由式（２）计算得到ｍ个死时间在与之对应的

式中，Ａ和Ｂ均为常数。对于串联系统的柱，则得式中，Ｐａ为辅助压力（对于单柱气相色谱系统而言，Ｐａ＝Ｐｏ）󰀀对于串联系统的柱，则得（对于单柱气相色谱系统而言，Ｐａ＝Ｐ１）通过实验测定分析试样在ｍ组ＰｉＰ和Ｐ条件下串联系统保留时间ｔＲｓ，利用下式计算串联系统容量因子ｋ

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反相高效液相色谱法测定选荞1号中的手性肌醇

反相高效液相色谱法测定选荞1号中的手性肌醇

反相高效液相色谱法测定选荞1号中的手性肌醇

引言

手性肌醇（myo-inositol）是一种重要的生物活性物质，广泛存在于各种生物体内，并且具有很多生物学活性，比如参与糖代谢和神经传导等过程。手性肌醇的不对称合成和制备是目前研究和开发手性药物和化学品的热点领域之一。

反相高效液相色谱法（RP-HPLC）由于其快速，灵敏和准确的性能，已经成为手性分析领域中最常用的技术之一。本文旨在介绍利用RP-HPLC方法对选荞1号中的手性肌醇进行分离和检测的研究。

实验部分

实验仪器和试剂

• RP-HPLC仪器：Waters e2695 HPLC系统

• 色谱柱：Waters XSelect HSS T3 C18 (4.6×150 mm, 5 μm)

• 手性肌醇标准品：Sigma-Aldrich

• 乙腈

• 磷酸盐缓冲液（pH 2.5）

样品制备

将选荞1号植物茎叶样品加入2 mL离心管中，加入200 μL乙腈，超声处理10分钟，过滤后，取滤液进行分析。

标准曲线

将手性肌醇标准品10 mg/L加入磷酸盐缓冲液中，用乙腈稀释获得不同浓度的标准溶液，分别注入色谱柱中进行分析。根据峰面积-浓度的线性关系，建立手性肌醇标准曲线。

手性肌醇的分离和检测

使用RP-HPLC对样品中的手性肌醇进行分离和检测。采用磷酸盐缓冲液和乙腈为流动相，在流动相的pH值为2.5时，在色谱柱上分离出手性肌醇的两个对映异构体。分离出的手性肌醇峰进行峰面积积分，根据标准曲线计算样品中手性肌醇的浓度。 结果与讨论

通过RP-HPLC，成功分离了选荞1号样品中的手性肌醇异构体。手性肌醇峰面积随浓度的增加呈现出良好的线性关系，建立了手性肌醇的标准曲线，浓度范围为0.01-10 mg/L，R2=0.99993。

选荞1号茎叶中含有手性肌醇，其对映异构体峰分别出现在9.1和10.5分钟处。通过比较对应的标准品的峰面积，计算样品中手性肌醇的浓度为2.3 mg/L。

HLA-G在肿瘤中的表达

HLA-G在肿瘤中的表达

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中发挥重要作用。近年来研究发现，胆汁酸还可激活法尼酯　

ｘ受体一　、ＴＧＫ５等信号分子，通过多种信号途径反馈调节自　

身的肠肝循环，同时还有降低血浆高密度脂蛋白和三酰甘油　

的作用，并且还参与糖代谢的调节，与体内糖脂代谢的动态　

平衡密切相关。因此，一些胆汁酸相关的信号途径很有希望　

成为治疗代谢性疾病的新靶点　。　

５．２胆汁酸与抗肿瘤恶性肿瘤是严重危害人类健康的重　

大疾病之一，而目前临床使用的化疗药物大多缺乏选择性，　

体内分布广泛，易引发毒副作用，导致患者不能耐受，降低药　

物疗效，因此，近年来人们一直致力于开展靶向抗肿瘤药物　

的研究。大量体内、外实验表明，胆汁酸（ＢＡ）衍生物具有显　

著的抗肿瘤活性及较少的不良反应。其中，一些以ＢＡ为载　

体的衍生物可明显提高药物在肝脏的浓度，从而降低原药的　

毒副作用，有些ＢＡ衍生物还能克服原药的耐药性，显示出良　

好的应用前景。研究表明，高浓度一氧化氮（ＮＯ）具有细胞　

毒性，可诱导肿瘤细胞凋亡、阻止肿瘤细胞的扩散和转移，然　

而，由于ＮＯ具有多重生物活性，若不能靶向给药便可能会　

引发毒副作用　。为此，有研究设计并合成了一系列ＢＡ—　

ＮＯ供体型衍生物以提高ＮＯ供体型抗肿瘤药物的靶向性，　

并进行了相关生物活性研究，相信随着研究的不断深入，有　

望设计出选择性更高、抗肿瘤活性更强的ＢＡ衍生物。　

参考文献　

［１］　Ｅｙｅｓ　Ｈ．Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ　ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ．Ａ　ｐｕｚｚｌｉｎｇ　ｄｉｓｏｒｄｅｒ　ｏｆ　ｐｒｅｇｎａｎｃｙ　『Ｊ］．Ｊ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ　Ｈｅｐａｔｏｌ　１９９７，１２：２１１－２１６．　

【＿２　１　Ｓｊ￣ｖａｌｌ　Ｊ，Ｒｅｙｅｓ　Ｈ．Ｂｉｌｅ　ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｉｎ　ｉｎ－　￣ａｈｅｐａｔｉｃ　ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ　ｏｆｐｒｅｇｎａｎｃｙ［Ｊ］．Ａｎｎ　Ｍｅｄ，２０００，３２（２）：９４—１０６．　［３］Ｍｅｎｇ　ＬＪ，Ｒｅｙｅｓ　Ｈ，Ｐａｌｍａ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｏｆ　ｂｉｌｅ　ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｐｒｏ—　ｇｅｓｔｅｍｎｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｕｒｉｎｅ　ａｎｄｓｅｒｕｍ　ｏｆ　ｗｏｍｅｎ　ｗｉｔｈ　ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ　ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｅｇｎａｎｃｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｈｅｐ￣ｏｌ，１９９７，２７：３４６－３５７．　［４］席彪．肝炎后肝纤维化的中医研究现状及展望［Ｊ］．长春中医　学院学报，２００５，２１（２）：５２－５３．　［５］曹泽毅．产科学［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，２００８：１３５．　［６］　王永春，余进进，王锡梅，等．妊娠期肝内胆汁淤积症血清胆汁　

血清甘胆酸检测方法研究进展

血清甘胆酸检测方法研究进展

2015.No31󰀶󰀹摘 要 上世纪业已公认，血清甘胆酸(SCG)是检测肝细胞损伤的特异性和敏感性指标,尤其是对各类肝炎、黄疸的鉴别以及肝癌、肝硬化的预后判断有较高的临床价值。近年来，SCG检测及高新分析仪器不断应用到临床检验中，故本文对SCG检测方法研究进展进行了综述。关键词 血清甘胆酸（SCG） 检测方法 进展人体内各种游离型和结合型胆汁酸化学结构相似，同分异构体较多，且血清中浓度较低，大部分为ng级，存在样品分离和定量检测双重困难。近几年，SCG检测在临床中的应用不断扩展，动态监测孕妇SCG对早期发现、诊断产科合并症从而提高母儿预后有着极大的临床意义[1]；风湿性心脏病患者，心肌炎患者，心肌梗塞患者血清结合甘胆酸含量显著升高，且病情严重程度与CG含量成正相关；检测SCG对鉴别扩张型心肌病与缺血性心肌病提供有价值的帮助。本文综述血清甘胆酸检测方法研究进展。1 免疫法1）放射免疫法（radioimmunoassay,RIA）。RIA基本原理就是标记抗原(Ag*)与非标记抗原(Ag)对特异性抗体(Ab)竞争结合，由于标记抗原与非标记抗原免疫原性相同，对特异性抗体的亲和力相同，因此与特异性抗体竞争结合能力相同，如果预先配制一系列已知浓度抗原标准品，加入定量Ag*和Ab进行免疫反应，然后采取适当方法分离，分别测定Ag*和Ag*-Ab的量(或剩余的Ag*的量)，作图即得标准抑制曲线，被测物质的量可从曲线上查得。常用的同位素有125Ⅰ、131Ⅰ，3H、14C等[1]。本法具有特异性好，灵敏度高且仪器自动化，操作简便，样品制备简单等优点，但操作人员接触和处置放射性物质是个严重的问题。国内自1982年首次报告应用于临床且广泛使用如肝功能血清甘胆酸检测方法研究进展张如超1 杨延音1 谭 韬1 孙化富2（1.重庆医药高等专科学校 401331；2.天圣制药集团股份有限公司 408300）试验，尤其是对各类肝炎、黄疸的鉴别以及肝癌、肝硬化的预后判断有较高的临床价值。20世纪以来，国内血清甘胆酸临床检测大多应用该法。2）化学发光免疫法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）。原理上化学发光免疫分析包含两个部分，即化学发光分析系统和免疫反应系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子(hM)，利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原(化学发光免疫分析)或抗体(免疫化学发光分析)上，或酶作用于发光底物。化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种，即化学发光标记免疫分析法和化学发光酶免疫分析。化学发光标记免疫分析又称CLIA，是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物，其通过起动发光试剂(NaOH·2H2O2)作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成, 为快速的闪烁发光。检测小分子抗原采用竞争法，检测大分子抗原则采用夹心法。化学发光酶免疫分析(chemium inescen tenzyme immunoassay,CLEIA)，属酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂，操作步骤与酶免分析完全相同：以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(ALP)，它们有各自的发光底物[1]。迈格鲁米(MAGLUMI)化学发光测定仪即为CLIA法。宋斌等、周黎等分别在得以解除。因此，Skp2基因被认为是一种原癌基因。许多研究表明在许多转化细胞株中有Skp2的过表达，另外在许多人类癌组织如人肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、软组织肉瘤、食道癌等肿瘤中Skp2均有高表达[4-5]，p27表达却是降低的，与肿瘤的恶性程度及不良预后相关。两者对于肿瘤的发生、发展过程起着重要作用，有望成为肿瘤监测及预后指标。5 展望Skp2、p27基因的发现为研究肿瘤发生、发展、诊断及治疗提供了一个新的热点。Skp2、p27蛋白在许多种恶性肿瘤中被检测到有异常表达，表明这两种基因产物在恶性肿瘤的产生中发挥着重要的作用，对评估患者的治疗、预后也有较大的价值。但Skp2与p27之间的作用机制尚未彻底清楚，还需要进一步广泛研究。Skp2作为一种可疑癌基因，可能成为癌症基因治疗的候选靶基因，抑制Skp2基因表达的反义技术或药物治疗可能会是一种很好的选择，而p27不仅是一个更有效的G1期阻断的诱导剂，阻滞肿瘤细胞恶性增生，更具有诱导凋亡的能力。因此转染p27的基因疗法是很值得进一步探讨，能够上调细胞内p27蛋白水平的抗肿瘤新药将为肿瘤的治疗提供新的途径。针对这两种基因的联合治疗可能会有协调治疗作用，将会是一个很有前景的治疗方向[6]。参考文献[1]Tanaka K, Suzuki T, Hattori N, Mizuno Y. Ubiquitin proteasome and parkin[J].Biochim Biophys Acta，2004，1695(1-3):235.[2]Schulman BA, Carmno AC.Jeffrey PD,et al.Insightsin to SCF ubiquitin ligases from the structure of the Skpl-Skp2 complex[J].Nature, 2000,408(6810):381-386.[3]招敏仪,陈润成,叶志东，等.Skp2和p27在甲状腺癌中的表达及其临床意义[J].临床和实验医学杂志，2013,12(21):1697-1699.[4]井昶雯,曹海霞,马蓉,等.非小细胞肺癌Survivin和Skp2的表达及其临床意义[J].中国肿瘤外科杂志，2013,5(4):226-229.[5]张连峰,魏争,韩利坤,等.RNAi沉默Skp2抑制胃癌细胞SGC7901侵袭作用的实验研究[J].医学综述，2014,20(12):2230-2232.[6]成军.现代细胞周期分子生物学[M].科学出版社，2010.2015.No31󰀶󰀺作者简介：张如超（1975-），男，主管药师，执业药师，学士，主要从事药物分析研究。通讯作者：杨延音（1980-），女，硕士，主要从事新药研发及药物质量分析。2012年和2013年检测血清CG和其他物质在ICP诊断及临床上的意义均采用该法[1]。2010年国家食品药品监督管理局(SFDA)批准甘胆酸(CG)检测试剂盒(增强化学发光免疫分析法)，由北京泰格科信生物科技有限公司生产[1]。目前该法应用不如RIA广泛。3）免疫透射比浊法（immunity transmission turbidity，ITT）。ITT是利用抗原和抗体的特异性结合形成复合物，通过测定复合物形成量的多少对抗原或抗体进行定量的方法。血清CG与反应体系中的CG抗体在一定条件下产生一定的浊度，反应液中形成的浊度在一定范围内与血清CG浓度相关。国内2013年报道该法用于测定血清CG，检测结果与RIA法一致，从方法学的精密度、干扰试验、回收试验来考量，结果令人满意，试验的敏感度符合临床要求，由于不必依赖放射免疫分析实验室，有生化分析仪的实验室都可开展，整个检测周期不超过20min，可为临床诊断提供及时信息而具明显优势，值得在基层医院推广应用。4）酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）。ELISA是酶联免疫分析法（enzyme immunoassay,EIA）的一种，酶联免疫分析法是将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏感度可达ng水平。将抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行即为ELISA。可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。目前有售人CG ELISA试剂盒（Human cholyglycine,CG Elisa kit），但应用不太广泛。5）胶乳增强免疫比浊法(Latex enhanced turbidimetric Immunoassay,LETIA)。LETIA一般使用聚乙烯聚合的胶乳微粒作为标记物，标记抗原或者抗体。标记后的抗原或者抗体与待测抗体和抗原反应，生成胶乳-抗原-抗体复合物。通过浊度的变化确定待测物的含量，本法可以使用竞争法和非竞争法两种。该法测定结果稳定，准确性、重复性好，线性范围达80mg/L，对实验者无危害，环境亲和力好，并适合日立、贝克曼、雅培、迈瑞、拜耳等各种全自动生化分析仪。目前应用仍不广泛。2 连续流动生物发光法（continuous-flow bioluminescence method）早在1984年，Roda A等报道了连续流动的生物发光法测定血清中主要胆汁酸。将7α-羟类固醇脱氢酶（EC 1.1.1.159），细菌荧光素酶（EC 1.14.14.3），和NAD +：FMN氧化还原酶（EC 1.6.8.1）共价联合固定于一内径1 m×1 mm的尼龙圈。该法是特异性检测7α-羟基胆汁酸，其他胆汁酸和类固醇不干扰。连续流动发光系统，其中反应器（尼龙线圈）被放置在内部探测器光电倍增管前，血清样品（5μL）可以直接注射。每测定管10～2500pM范围内浓度与响应是线性相关。精度度和日间精密度皆（CV 5%～10%），每小时可以分析超过20个样品，检测结果与放射免疫法、酶免疫测定法和HPLC等其他方法所得到的结果一致。该法被广泛应用，有待深入研究。3 色谱法1）薄层扫描定量法或薄层荧光法。该法主要在RIA出现之前应用，用硅酸薄层色谱分离，扫描或荧光法定量。1976年Chavez等使用一个薄层色谱系统即异丙醇+冰醋酸（93:7）分离游离胆汁酸、牛磺酸缀合物和甘氨酸结合物。1989年华西医科大学孟高渊等用异辛烷+乙酸异戊醋+丙酸+正丙醇+冰醋酸+水+正丁醇+异丙醚(9∶5∶3∶2∶2∶1.4∶1.2∶1)展开，15%的磷钼酸乙醇溶液喷雾显色后扫描定量。2）GC、GLC法。1969年Y. ASakura报道了气液色谱检测血清胆汁酸，分离检测出甘胆酸，此法应用少有报道。近几年GC、GLC多与MS联合应用。3）高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）。高效液相色谱法是血清甘胆酸检测方法中除RIA外应用最广泛的检测法，很多学者不断研究探讨，几种常见HPLC法检测CG的方法有Sep-pak小柱、酶解；Sep-Pak C18小柱萃取；衍生化、Sep pak C18萃取；Sephadex LH-20分离、Sep-Pak SIL等。HPLC法具有分析速度快；分离效率高；灵敏度、精密度和重现性高；操作自动化等优势，因而应用范围较广泛，但由于人体内各种游离型和结合型胆汁酸化学结构相似，同分异构体较多，且血清中浓度很低，HPLC法CG检测需要对样品进行水/酶解、分离萃取衍生化等预处理，远远不能满足床前检验的需要，加上专业技术性强，仪器设备相对昂贵，基层单位使用受限。4 质谱法随着科技的发展，HPLC与MS等结合使用的报道渐多，如高效液相色谱法-串联质谱法（HPLC-MS）；高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）与电喷雾接口；负离子热喷雾液相色谱-串联质谱法。但短期内基层单位依然难以普及。5 电泳法1983年J.C. Reijenga描述了在95%甲醇中等速电泳测定人体结合型胆汁酸的方法，但该法报道很少。6 方法前沿2004年美国Waters公司推出了最新研制的ACQU ITY超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography， UPLC)，采用1.7μm细粒径的新型固定相，全面提升了液相色谱的速度、灵敏度和分离度，造就了液相色谱性能上的飞跃和进步并形成分离科学的一个新兴领域。2012年García-Canaveras J C、2013年Suzuki Y等相继报道了UPLC-MS检测CG的方法。相继报道的最新CG检测方法有超高效液相色谱-多反应监测-质谱法（UPLC-MRM-MS）、超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）、超高效液相色谱/串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-HDMS）、大气压化学电离-串联质谱正离子模式 (LC-APCI-MS/MS)、超临界流体色谱-电喷雾电离串联质谱法(SFC-ESI-MS/MS)、超高效液相色谱-串联电喷雾电离串联质谱法(UPLC-ESI-MS)等。UPLC-MRM-MS敏感，快速，可再生，通过量化31种主要和次要胆汁酸，在21分钟内同时测定出不同种类（人类，大鼠，鼠标）的组织和血清胆汁酸剖面。该方法根据FDA的指导原则验证，精密度和日间精密度分别小于8.6%和16%，准确度（相对误差测量为11.9%～8.6%），线性（R2＞0.996，动态范围两到四个数量级），定量限在2.5～20 nM。UPLC-MS-MS法5分钟内将21种胆汁酸充分分离，检测限 (LOD)血浆中低于0.25～7.5 ng/mL，肝脏样品低于2.5～10ng/g。参考文献[1] 王红红.甘胆酸(CG)在妊娠及其合并症中的监测价值[D].山西医科大学, 2011.～

猪胆粉中主要胆汁酸类成分含量测定

猪胆粉中主要胆汁酸类成分含量测定

猪胆粉中主要胆汁酸类成分含量测定

摘要：目的 对不同厂家所生产的猪胆粉中胆汁酸类成分含量进行对比研究。方法 建立HPLC法分析18批次猪胆粉药材中胆汁酸类成分含量。结果 胆汁酸类成分含量测定结果表明，不同来源猪胆粉中猪去氧胆酸含量具有显著差异，提示该成分对猪胆粉药材的质量控制有指标性意义。结论 本研究建立了猪胆粉中主要胆汁酸类成分的测定方法，可为猪胆粉药材质量控制提供依据。

关键词：猪胆粉；胆汁酸；含量测定

猪胆粉是常用的传统中药品种，可用于顿咳，哮喘，热病燥渴，目赤，喉痹，黄疸，泄泻，痢疾，便秘，痈疮肿毒等症治疗。猪胆粉中主要含有胆汁酸类、胆色素类、氨基酸与蛋白类、脂类及无机物等类成分。其中胆汁酸类成分是其主要成分，主要有猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺猪去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸和甘氨鹅去氧胆酸等，其中尤以甘氨结合型胆汁酸含量为最高[1-2]。本文对不同厂家生产的18批次猪胆粉中胆汁酸类成分含量进行研究，旨在为其质量评价提供参考。

1. 仪器与试剂

1.1实验仪器

LC-2030C Plus高效液相色谱仪（日本岛津制作所）；ELSD-LT11 蒸发光散射检测器（日本岛津制作所）；SQP-SECURA225D-1CN电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ-800KDE超声提取器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2实验材料

甘氨猪去氧胆酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号Y23N9K75826，纯度97%）；熊去氧胆酸（批号110755-201704，纯度99.7%）；猪去氧胆酸对照品（批号100087-201411，纯度99.4%）；鹅去氧胆酸（批号110806-201708，纯度91.7%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（德国Merck公司，色谱纯）；其他试剂为分析纯；水为超纯水。

猪胆粉样品共18批，编号1~5（安徽科宝生物工程有限公司，批号分别为：Y190101、Y190102、Y190103、Y190301、Y190302）；6~10号（河南利伟生物药业股份有限公司，批号分别为：20180801、20190501、20190502、20190503、20190504），11~18（福建省仙游县南丰生化有限公司，批号分别为Y1-191109、Y1-191110、Y1-190912、Y1-191113、Y1-191013、Y1-191204、Y1-19004、Y1-19005）。以上样品经陕西国际商贸学院中药学教研室鉴定为猪科动物猪Sus