实验一高效液相色谱法测定水样中的苯甲酸
一、实验目的
1.通过对高效液相色谱法测定样品中的苯甲酸
2.掌握采用高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法
3. 掌握外标法的步骤和计算方法
二、实验原理
苯甲酸和苯甲酸钠是食品行业通用的防腐剂，是我国目前最常用的食品防腐剂，其主要作用是防止由微生物的活动而引起的食品变质。据科学报道，目前影响我们食品安全的最大问题是食品腐败和微生物的繁殖，正是由于食品中使用了防腐剂，而使我们避免了更多食品中的不安全因素。面粉中添加了增白剂最终转化成的苯甲酸不超过60 ppm，我国GB2760－1996《食品添加剂卫生使用标准》中规定，苯甲酸及苯甲酸钠在酱油、醋中的最大使用量为1000 ppm，葡萄酒中为800 ppm，碳酸饮料中为200 ppm。
苯甲酸分子式为：
苯甲酸具有紫外吸收特性，可用紫外检测器进行检测。标准品或待测样品进入液相色谱之后，经反相色谱柱分离，紫外检测器检测，可获得以保留时间为横坐标，紫外信号（电压或电流）为纵坐标的色谱图，不同物质保留时间不同，并且物质浓度与色谱峰面积成正比。
本实验通过高效液相色谱采用外标法对常见饮料（如雪碧）中苯甲酸进行测定（实际样品测定之前必须进行过滤），根据保留时间和峰面积进行定性和定量。
外标法常用于测定主要成分含量，是以待测组分的纯品作为对照品，以对照品和待测组分的保留时间和峰面积相比较进行定性和定量分析，外标法包括工作曲线法和外标一点法，本实验采取工作曲线法。配置5个不同浓度的纯品，分别进行色谱分析，得到峰面积和浓度的线性关系表达式。将待测组分峰面积代入公式，得到待测组分浓度。
三、仪器与试剂
仪器：高效液相色谱仪；C18色谱柱；容量瓶（50mL）、10ml比色管、10ml 移液管、胶头滴管、洗耳球、小烧杯、针筒过滤器、2ml进样瓶。
试剂：苯甲酸（分析纯）；乙腈（色谱纯）；重蒸馏水。
四、实验步骤
1.按仪器操作规程开机，设定流动相为乙腈/水=60/40，平衡色谱柱。
2. 标准样品溶液的配制
（1）1 g/L的苯甲酸溶液：准确称取100mg苯甲酸，用乙醇溶解后转入100ml 容量瓶中并定容，混匀。（每班一个）
（2）10 mg/L苯甲酸溶液：用1ml移液管准确移取1 g/L的苯甲酸溶液0.5 ml 入50ml容量瓶，加纯水至刻度线，混匀。（每大组一个）
（3）分别取10mg/L的苯甲酸溶液2、4、6、8 ml至10ml比色管中，定容至刻度线获得浓度分别为2，4，6，8 mg/L。
（4）将配制好的标准溶液倒入2ml进样瓶（2、4、6、8、10 mg/L共5个浓度）。
3. 待测样品的前处理
提前购买听装雪碧，稀释20倍（取0.5 ml至10ml比色管，用水稀释至刻度线），用注射器取5ml左右，用针筒过滤器过滤至2ml样品瓶中。
4. 进样分析
（1）建立液相色谱测定方法
色谱柱：C18柱（规格）；流动相：水-乙腈（40：60）；流速1.0mL/min，检测波长230nm；柱温20 o C，进样量10ul。按照上述色谱条件建立液相色谱测定方法，并保存。
（2）将标准样品和待测样品放入自动进样器中，将样品名称、数据保存位置、样品放置位置、测定方法等信息输入测定序列，编辑好序列后保存序列。
（3）运行序列开始测定。
五、数据处理
根据工作溶液浓度和峰面积的关系作出校准曲线（以峰面积为横坐标，浓度
为纵坐标），C=ax。
其中： C——苯甲酸的浓度（mg/L），
X——峰面积（软件自动积分获得），
a——斜率。
根据测试样品的峰面积值可计算出其中苯甲酸的浓度C待测=tax待测，
——待测样品中苯甲酸的浓度（mg/L）其中：C
待测
t——待测样品的稀释倍数
x待测——待测样品经稀释后测得的峰面积计算结果保留至小数点后两位。
六、问题讨论
1.高效液相色谱一般由几部分组成？
2.反相色谱和正相色谱有什么区别？
实验二物质成分的毛细管气相色谱分析
-----苯甲醇的相对校正因子测定
一、实验目的
1.掌握气相色谱内标法的定量依据；
2.掌握气相色谱仪的结构和使用方法；
3.熟悉相对校正因子的测量方法。
二、实验原理
苄醇是重要的有机中间体。目前检测苄醇的标准方法是气相色谱内标法定量。内标法是将一种纯物质作为内标物加到试样中，进行色谱分析，根据待测物质和内标物的质量及其在色谱图上响应的峰面积和校正因子，求出待测组分含量的一种方法。
由于内标物加到试样中，它与待测组分的处理条件相同，因而在一定程度上可以克服样品前处理、进样量和仪器条件不一致等引起的误差，是一种比较准确的定量方法，特别适合于复杂样品和微量组分的定量分析。
三、仪器与试剂
仪器：气相色谱仪（带FID）；Agilent毛细管柱；微量注射器（10μL）；3个滴瓶（分别用于盛放苯甲醇、邻苯二甲醚和无水乙醇）。
试剂：苯甲醇（分析纯）；内标物邻苯二甲醚（色谱纯）；无水乙醇（分析纯）；丙酮（清洗进样针）。
四、实验步骤
1、试剂配置
（1）苯甲醇标准液
准确称取苯甲醇50mg左右，约3滴，置于10mL比色管中，以无水乙醇溶液定容至刻度。
（2）邻苯二甲醚标准液
准确称取邻苯二甲醚（内标）50mg左右，置于10mL比色管中，以无水乙
醇溶液定容至刻度。
（3）混合标样工作液
a. 用10毫升的比色管，加入3-4mL 无水乙醇，在分析天平上调零，用干净滴管滴加苯甲醇3-6滴，质量控制在60-200 mg 之间，记录苯甲醇的质量（每组同学间加入苯甲醇的质量有个梯度，3滴是88.1mg 左右）。
b. 滴加内标物邻苯二甲醚，2-3滴，记录内标的质量（质量控制在50~60mg 之间，2滴是69.4mg 左右，加入2滴即可），用无水乙醇定容至10毫升。
2、 气相色谱条件
（1）气体流量：载气（氮气）30mL/min ；氢气30mL/min,空气400mL/min ；
（2）温度条件：进样口温度250℃；检测器温度250℃；柱箱温度，程序升温：从50度以15℃/min ，升温至250℃；保持2分钟。
3、 定性分析
根据实验条件，待气相色谱仪状态就绪后（基线平直），用微量注射器分别吸取苯甲醇、邻苯二甲醚标准液进样，进样量1μL ，记录每个纯样的保留时间。
4、 定量分析
待气相色谱仪状态就绪后，每一组选取一个混合标样工作液，用色谱进样针，取混合标样1.0μL 进样，记录苯甲醇和邻苯二甲醚的色谱数据（保留时间和峰面积），计算i s m m 和1s
A A 值。因为加入的样品和内标物的质量不同，各个组之间质量之比不同，因此峰面积之比也不同，每4个组在一起画一条m i /m s -A i /A s 的关系线，这个关系线的斜率即为相对校正因子K 的值。相对校正因子确定后，以后根据加入的内标物的质量、峰面积之比就可以求出被测样品中苯甲醇的质量。
五、数据处理
相对校正因子K=质量之比/色谱峰面积比=（m i /m s ）/(A i /A s )
（1）
其中： s A ——第i 次分析时标样中内标物峰面积； i A ——第i 次分析时苄醇峰面积；
i m ——第i 次分析时苯甲醇质量，
s m ——第i 次分析时内标物质量。
