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高二生物学案
专题1 §1.2基因工程的基本操作程序
一、学习导航
1．知识网络
目的基因：指编码蛋白质结构基因
基因组文库
从基因文库中获取目的基因
部分基因文库
原理：
目的基因的获得方法前提条件：
利用PCR技术扩增目的基因过程：
特点：
人工合成
目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传
给下一代，并使目的基因能够表达和发挥作用。
基因表达载体的构建目的基因
（基因工程的核心）基因表达载体的组成：启动子
终止子
标记基因
转化：目的基因进入受体细胞内并在受体细胞
内维持稳定和表达的过程
农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞导入植物细胞的方法：基因枪法
花粉通道法
方法：导入动物细胞的方法：显微注射技术
导入微生物的方法：Ca2+
检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因
方法：分子杂交技术（DNA探针+转基因生物DNA）目的基因的检测和鉴定检测目的基因是否转录
方法：分子杂交技术（DNA探针+转基因生物mRNA）
检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原—抗体杂交
鉴定：对生物进行个体水平的鉴定
2．学习目标
简述基因工程原理及基本操作程序。
3．重难点
学习重点：基因工程基本操作程序的四个步骤。
学习难点：
(1)从基因文库中获取目的基因。
(2)利用PCR技术扩增目的基因。
二、自学评价
基因工程的基本操作程序主要包括4个步骤：的获取、基因表达
的构建、将细胞、的检测与鉴定。（一）目的基因的获取
1、概念：目的基因主要是指编码蛋白质的基因,也可以是一些具有调控作用的因子。
2、来源：（1）可以从自然界中已有中直接分离出来。
（2）从中获取目的基因。
3、基因文库：（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多片段导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
（2）种类：基因组文库――含有一种生物的。
部分基因文库――含有一种生物的。
（如cDNA文库）
4、获取目的基因的方法：
（1）从基因文库中获取目的基因
根据目的基因的有关信息，如根据基因的序列，基因的功能、基因在上的位置、基因的转录产物，以及基因的表达产物等特性来获取目的基因。
（2）利用PCR技术扩增目的基因：①原理：PCR技术是一项在生物体外复制片段的核酸合成技术。②前提条件：提供已知的核苷酸序列，根据这段序列合成。③过程：目的基因DNA 变性形成DNA单链，与结合，然后在的作用下延伸形成DNA。④特点：扩增，即2n(n为扩增循环次数)。
（3）人工合成方法：当基因较小，核苷酸序列已知时，可以用人工方法合成（例如，通过直接合成）。
（二）基因表达载体的构建
1、表达载体的组成
表达载体：目的基因、、、标记基因。
启动子：它是一段有，位于基因的首端，它是的识别和结合部位，驱动转录mRNA。
终止子：位于基因的尾端，终止过程。
标记基因：用于受体细胞是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
2、构建表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中存在，并且给下一代，同时使能够表达和发挥作用。
（三）将目的基因导入受体细胞
1、将目的基因导入植物细胞
（1）农杆菌转化法：①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和
表达的过程，称为。②农杆菌特点：在自然条件下能感染植物和
植物，对植物没有感染力。Ti质粒的可以转移至受体细胞，并整合到受体细胞的上。
（2）基因枪法又叫。
（3）花粉管通道法：利用花粉管通道使目的基因借助进入。
2、将目的基因导入动物细胞
（1）方法：。
（2）操作程序：目的基因的提纯→取卵（受精卵）→→移植输卵管或子宫内→新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
（1）原核生物的特点：，。
（2）转化：用处理细胞→细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收分子，完成转化。
（四）目的基因的检测与测定
1、检测：①检测转基因生物的染色体DNA上的，原理是技术。
②检测目的基因是否转录出，原理是技术。③检测目的基因是否翻译成蛋白质，原理是。
2、鉴定：个体生物学水平鉴定，如抗虫、抗病鉴定等。
三、知识拓展
1、原核细胞基因结构
（1）编码区和非编码区
能编码蛋白质的区段叫做编码区；不能编码蛋白质的区段叫做非编码区，在非编码区上有调控遗传信息表达的核苷酸序列。
（2）
2、真核细胞的基因结构
（1）外显子和内含子
外显子能编码蛋白质，内含子不能编码蛋白质。
（2）非编码区和非编码序列
非编码序列包括非编码区和编码区的内含子。
一个典型的真核细胞基因结构示意图
(3)原核细胞的基因结构与真核细胞的基因结构的异同点
原核生物的编码区转录为相应的mRNA；真核生物的转录为初级mRNA，接下来内含子转录的部分被切割掉，使外显子转录的部分连接起来才能成为成熟的mRNA。
§1.1 重组技术的基本工具
（一）思考与探究
1.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段：
(1) …CTGCA(2) …AC(3) GC…
…G…TG CG…
（4）…G (5) G…(6) …GC
…CTTAA ACGTC……CG
(7) GT…(8)AATTC…
CA…G…
你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？
答：
2和7能连接形成…ACGT…
…TGCA…；
4和8能连接形成…GAATTC…
…CTTAAG…；
3和6能连接形成…GCGC…
…CGCG…；
1和5能连接形成…CTGCAG…
…GACGTC…。
2.联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？
提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
3.天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？
提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。
（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。
（2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。
（3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。
（4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。
（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
4.网上查询：DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
提示：迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。
（二）寻根问底
1.根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
2. DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
