高通量药物筛选利器——HTRF,在生物标志物(biomarker)中的应用

HTRF技术介绍快速、稳定、不需洗涤、操作简单、易于自动化和微型化。

上述优势使得Cisbio的HTRF技术一直是药物研发领域的领先技术之一，并广泛用于免疫检测。

该技术已经在知名医药公司、生物技术公司和学术研究机构应用了15年以上。

HTRF（均相时间分辨荧光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法。

该技术结合了荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF，Time-Resolved Fluorescence)）两种技术。

这种结合将TRF的低背景特点和FRET的均相实验方式融合在一起，使得HTRF技术拥有如下优势：实验方式Array灵活，具有很高的灵敏度和通量，实验数据稳定可靠，假阳性率较低。

虽然HTRF也是基于TR-FRET的化学技术，但它的许多特点把它与其它TR-FRET产品区分开来。

这些特点包括使用了镧系元素（铕和铽），从而具有非常长的半衰期，很大的Stroke's shift（如右图所示，Eu3+ Stroke’sshift > 300 nm）；但是HTRF有其独特的地方，镧系元素与络合的穴相结合，这种结合的穴状物与其它所有TR-FRET产品使用的螯合物相比，显著增加了稳定性（可耐受低pH值、金属离子、DMSO、EDTA等）；专利的比值测量能矫正淬灭和样品带来的干扰。

FRET技术简介FRET技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为（能量）供体和（能量）受体。

供体被外来能源激发（例如闪光灯或激光），如果它与受体在足够近的距离之内，可以将能量共振转移到受体上。

受体受到激发，发出特定波长的发射光。

将供体和受体分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将受体和供体拉到足够近的距离，产生能量转移。

由于受体分子的发射光来自于能量转移，所以在实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。

这种均相的实验方式操作简单，而且减少了实验时间和花费。

一般地，在FRET实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰期非常短，其背景荧光较强。

背景荧光主要来自于样品成分，包括缓冲液、蛋白质、化合物和细胞裂解液。

检测到的荧光强度必须对这些自发荧光进行校正，极大地影响了实验灵敏度，并使数据分析变得复杂。

背景荧光非常短暂（寿命为纳秒级），可以利用时间分辨荧光方法将其去除。

1TRF技术简介Array如前所述，在生物溶液或血清中的很多化合物和蛋白质是自发荧光的，利用传统的快速荧光基团进行检测极大限制了实验灵敏度。

使用长寿命的荧光基团结合时间分辨的检测方式（在荧光激发和发射检测之间有一个时间延迟）可将快速荧光的干扰降到最低。

时间分辨荧光（TRF）利用稀土元素中镧系元素的独特性质。

在TRF中常用的镧系元素是钐（Sm）、铕（Eu）、铽（Tb）和镝（Dy）。

与传统荧光基团相比，它们具有大的Stoke's shifts和非常长的发射半衰期（从微秒到毫秒），这使它们在生物学荧光应用领域中日益重要。

通过直接激发使镧系元素离子产生荧光是不容易的，因为这些离子很难吸收光子。

镧系元素必须首先与有机分子形成复合物，有机分子收集光子并通过分子内非放射过程转移到镧系元素上。

稀土元素螯合物和穴状化合物是能量收集装置的典型代表，它们收集能量并转移到镧系元素离子上，后者则发出其特征性的长寿命的荧光。

为了能够成功应用于生物学检测中，稀土元素复合物应该具有特定的性质，包括稳定性、较高的发射光产率，并且能够与生物分子连接。

除此之外，当直接在生物溶液中反应时，能够耐受荧光淬灭就显得尤为重要。

稀土元素螯合物稳定性较差，而且有的化合物可竞争螯合物活性基团，当与FRET技术结合在一起时其灵敏度也受到限制。

如果稀土元素与穴状化合物结合，许多限制因素都可去除。

23专利号：US Patent US 5,527,684由于在该结构上的贡献，Prof. J.M. Lehn’s 在1987年获得了诺贝尔HTRF 技术的能量供体（Donor ）和能量受体（Acceptor ） HTRF 的供体是铕穴状化合物（Eu3+ cryptate ）或Lumi4™铽穴状化合物（Tb2+ cryptate ），后者是近年与Lumiphore 公司合作的结果，激发效率更高。

两者的能量受体（Acceptor ）均可为XL665和d2。

XL665和d2激发波长为620nm ，发射波长为665nm ，位于红外光区，进一步降低了生物溶液对实验的影响（生物学成分很少在红外光区有自发荧光）。

对于铽穴状化合物来说，其受体也可以是Fluorescin 、GFP 等发绿色荧光的分子，所以可以进行双标记测量。

XL665是改良过的别藻蓝蛋白（APC ），将APC 的亚基偶联，增加了稳定性。

d2是第二代受体，光谱学特征与XL665相同，但是分子量较小，约为1KD ，可减少空间位阻对实验的影响。

当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接近时，在激发时被穴状化合物捕获的部分能量释放，发射波长为620nm ；另一部分能量转移到XL665或d2，发射波长为665nm 。

665nm 的发射光仅仅由donor 引起的FRET 产生。

所以，当生物分子相互作用时，有两个激发光620nm 和665nm ；当不存在相互作用时，只有620nm 一个激发光（见右图）。

穴状化合物与螯合物穴状化合物的形成是将一个阳离子纳入到一个立体笼中。

笼能收集光然后将能量转移到核心的镧系元素。

大环的性质有利于跟镧系元素紧密相连，这种不可破的连接会形成异常稳固的复合体。

穴结构能耐受一些特殊的实验条件如大量存在的阳离子（Mg 2+和Mn 2+等）、螯合物（EDTA ）、溶剂或者温度。

从HTRF 能应用到临床诊断（TRACE®技术和Kryptor®工作站技术）就能看出它也适用于浓度高的血清（50%）。

在读板前或者孵育时加入氟离子能增强实验对大量化合物的抗干扰性。

穴没有光漂白性，多次读数后信号没有损失，因此能按照需要的次数去读，所以可以进行动力学检测。

HTRF技术的优势∙背景低，化合物和培养基的干扰小∙均相检测（不需要洗板），操作简单∙实验稳定，对酸性溶液、Mg2+、Mn2+、DMSO、EDTA比较耐受，并且读数稳定24小时以上，甚至可达7天∙应用灵活多样∙易于实现微型化HTRF的应用HTRF技术被广泛应用于细胞实验和生化实验，并应用于药物研发的不同阶段，从实验方法的建立、高通量筛选（HTS），lead到hit，到临床前研究。

这是一种很灵敏且稳定的技术，可以使用384和1536孔板。

自从10年前HTRF技术进入药物研发领域以来，研究者采用该技术加快了很多基于抗体的研究，包括GPCR（受体配体结合，受体二聚化，cAMP和IP-1的检测，以及磷酸化ERK的定量）、激酶、细胞因子和生物标志物、生物过程（抗体和蛋白生产）等，以及蛋白和蛋白、蛋白和多肽、蛋白和DNA/RNA相互作用的实验。

HTRF具有与ELISA同等的检测范围和检测极限，但是它不需要洗板，可以极大地减少实验时间，所以HTRF技术可以取代大部分ELISA实验，为均相ELISA。

4生物标志物（Biomarker）介绍生物标志物这一概念首次出现于美国国家研究委员会（NRC）在1983年出版的红皮书《联邦政府风险评估》中，是医药领域一个十分热门的课题。

随着对个性化用药的关注与重视，研究人员开始致力于寻找那些在人体内因服用药物而发生相应变化的分子。

基因组学、蛋白质组学、代谢组学及生物信息学等新兴学科的兴起，使生物标志物的研究工作也得到了长足的发展。

生物标志物一般是指可提供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。

生物标记物不仅可从分子水平探讨发病机制，而且在准确、灵敏地评价早期、低水平的损害方面有着独特的优势，可提供早期预警，很大程度上为临床医生提供了辅助诊断的依据。

同时，生物标志物作为终端替代物，还可以帮助制药公司研发出更好更多的目标药物来治疗疾病。

例如，在医学领域，生物标志物可用于疾病诊断（例如前列腺特异性抗原PSA可用于前列腺癌诊断）、判断疾病分期（例如恶性肿瘤的分期）或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。

Cisbio利用其专利HTRF技术，开发了适用于基础科研、初筛、复筛的生物标志物检测解决方案，主要应用于以下几方面：∙炎症研究：主要是细胞因子，包括人肿瘤坏死因子（hTNFα、hTNFβ）、人白介素（hIL1β、hIL2、hIL6、hIL8、hIL17）和小鼠白介素（mIL17）和干扰素（IFNγ）等，以及PEG2、LTB4、LTC4、组胺等炎症因子∙代谢疾病研究，包括：皮质醇、醛固醇、雌二醇、睾酮、胰岛素、胰高血糖素、cGMP、载脂蛋白A1/B∙中枢神经系统（CNS）相关疾病研究，包括：β -淀粉样蛋白、BAC1-1炎症研究检测试剂细胞因子（Cytokine）检测背景简介细胞因子是由免疫系统细胞以及其他类型细胞主动分泌的一类小分子可溶性蛋白质与多肽（图1），是除免疫球蛋白和补体之外的又一类免疫分子，包括淋巴因子、干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、趋化因子和集落刺激因子等。

它是免疫系统细胞之间，以及免疫系统细胞与其他类型细胞间联络的核心，能改变分泌细胞自身或其他细胞的行为或性质，通过与细胞特异的膜受体而起作用。

细胞因子的主要生物学作用有：1）抗感染、抗肿瘤作用，如IFN、TNF等；2）免疫调节作用，如IL-1、IL-2、IL-5、IFN等；3）刺激造血细胞增殖分化，如M-CSF、G-CSF、IL-3等。

4）参与和调节炎症反应，如：IL-1、IL6、TNF等。

细胞因子共分六类：白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子和趋化因子。

5图1.细胞因子网络白细胞介素或白介素（interleukin，IL）是一组在白细胞或免疫细胞之间相互作用的细胞因子。

最早发现在白细胞中表达，作为细胞间信号传递的手段。

实际上，白细胞介素可以由多种细胞产生，免疫系统的功能在很大程度上依赖于白细胞介素。

一些罕见的白细胞介素缺陷不足都常出现自身免疫性疾病或免疫缺陷。

不同的白介素在不同的细胞中产生，其效应也各有差异（见表1）。

表1.白介素类型、产生细胞及其效应白介素产生细胞效应1 单核巨噬细胞，树突状细胞，纤维母细胞内皮细胞T和B细胞的增殖和分化，刺激造血细胞，参予炎症反应2 活化的T细胞T和B细胞的增殖分化，增强NK细胞，单核细胞杀伤活性3 活化的T细胞多能造血干细胞增殖，促进肥大细胞，嗜酸，嗜碱性粒细胞增殖与分化4 活化的T细胞B和T细胞增殖，刺激造血祖细胞增殖与分化，诱导IgE、IgG 产生5 活化的T细胞促进B细胞增殖与分化，促进嗜酸性粒细胞增殖与分化，诱导IgA产生6 淋巴细胞单核细胞纤维母细胞促进B细胞分化、促进肝细胞产生急性期蛋白，抑制乳腺癌细胞、刺激骨髓瘤细胞、刺激造血细胞，参与炎症67 骨髓及胸腺基质细胞促进前T、前B细胞增殖，促进成熟T细胞生长，促进血小板生成8 单核巨噬细胞血管内皮细胞中性粒细胞活化和趋化作用，T细胞趋化作用，促进血管生成，参与炎症9 活化的T 细胞促进TH产生细胞因子，促进肥大细胞增殖，刺激造血细胞10 活化的T细胞，B细胞单核巨噬细胞抑制TH产生细胞因子，促朝进胸腺细胞增殖，促进B细胞增殖11 骨髓基质细胞促进B细胞分化，刺激造血细胞，促进血小板生成12 B细胞促进TC，NK，LAK细胞杀伤功能，透导细胞免疫13 活化的T细胞抑制细胞因子分泌和表达，刺激B细胞增殖和CD23表达，透导IgE产生17 外周血T细胞诱导人成纤维细胞分泌IL-6和IL-8，并促进人成纤维细胞表达细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的表达干扰素（Interferon，IFN）是细胞因子中的一个家族，是动物细胞受多种因素诱导（如病毒）后分泌的具有抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫及抗肿瘤等作用宿主特异性蛋白质。