细胞培养考试题
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细胞培养试题
1、体外培养包括几类？什么是组织培养技术?
体外培养包括组织培养、细胞培养、器官培养三类；组织培养技术是 指：从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营 养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。
2、进行细胞培养的基本条件包括哪些?
（1）无污染的环境。无毒和无菌培养环境是保证培养细胞生存的首 要条件。（2）适宜温度。人体细胞的适宜温度为C + C,偏离时，会 影响细胞代谢，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力比对高温强。（3） 气体和pH值。开放培养时（碟皿或培养瓶松盖培养），一般置于95% 的空气加5%CO2混合气体环境中。O2参与三羧酸循环，产生能量 供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。多数细胞缺氧不能生存。
CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，作用是维持培养基的 pH值，细胞要求。（4）营养物质。包括糖，无机盐，氨基酸，维生 素，促细胞生长因子等。牛血清是提供生长因子和细胞所需物质的来 源。（5）渗透压。260-320 m
Osm/L培养基 3、原代培养、传代培养、二倍体细胞、克隆细胞株的概念。
原代细胞：直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养 物。传代细胞：初代培养细胞从第一次传代培养后具有增殖能力的细 胞群。二倍体细胞：细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体 数相同或基本相同的细胞群。克隆细胞株：从一个经过生物学鉴定的 细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单个细胞增殖形成的细胞群。
4、制备单细胞悬液的方法主要有哪些？
1 ）悬浮细胞的分离方法是离心法，最简单方法是采用 1000r/min 的低速离心 10min。
2）实体组织材料的分离方法有机械分离法和消化分离法，机械分 离法包括切割分离法（组织培养法）和机械挤压分离法；消化分离法 包括胰蛋白酶消化法、胶原酶消化法、胰蛋白酶和胶原酶协同用法、
EDTA 消化法。
5、简述细胞冻存、复苏和运送的方法。
10%DMSO）;取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入新鲜培养液, 低速离心 5 分钟；弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞 悬液，分装至冻存管中。密封后标记冻存细胞名称，日期，细胞状态 也可标记，冻存者姓名。（细胞冻存是慢冻的过程：4C 1小时，-20C 1小时，-80C过夜，液氮中保存）
（2）细胞复苏方法（快融）：从液氮中取出冷冻管，迅速投入 37〜 38 C水浴中，使其融化（1分钟左右）。5分钟内用培养液稀释至原 体积的 10 倍以上。低速离心 10 分钟。去上清，加新鲜培养液培养刚 复苏的细胞。
（3）细胞运送方法：①冻存运送：液氮中；②充液法：细胞传代后 贴壁，瓶内充满培养液，密闭封口，保温携带。
6、细胞培养的基本方法有哪几种？
1）初代细胞培养：贴壁细胞初代培养、组织块培养法、悬浮细胞 的初代培养；
2）传代细胞培养：悬浮生长细胞传代、半悬浮生长细胞传代、贴 壁生长细胞传代；
3）球体细胞培养；
4）悬浮细胞培养：成批培养、连续培养、微载体细胞培养法 7、干细胞有何特性，如何分类 特性：①具有自我更新能力②有无限增殖潜能③可分化成特定组织细 分类： 按分化能力，分全能、多能、专能性干细胞。
① 全能性干细胞，又称胚胎干细胞，如受精卵。 1）细胞冻存方法：预先配制冻存液（ 含 20% 血清培养基、 ② 多能性干细胞，又称为成体干细胞，如囊胚中的内囊细胞。
③ 专能干细胞，如造血干细胞 8、简述贴壁细胞传代培养法的过程。
1）弃去培养瓶中的培养液
2） 加入 1-2 ml ％的胰蛋白酶液 （以消化液能覆盖整个瓶底为准） 静置2-10 min （显微镜下动态监测）。
吸去胰蛋白酶液，加入培养液。
用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。
吸取 1/3—1/4细胞悬液，接种于新的培养瓶内。
加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。
将后者放入培养箱中培养。
9、简答基因转导的目的和用途， 并列举细胞内基因转导的常用方法。
将外源性基因 （或基因组 DNA） 导入细胞的技术称为基因转导。
目的： 使外源基因能整合入受体细胞基因组中。
用途：研究基因表达、结构和功能。培养细胞是最适宜的对象。基因 转导，尤其对于检测癌基因，更为常用。
常用方法： 染色体转导、细胞融合技术、磷酸钙法、电击法、脂质体 法、显微注入法、逆转录病毒介导法、转基因技术（生殖细胞）等
1）染色体转导
①细胞融合技术
②染色体转导
2）基因转导
① 基因转染：磷酸钙法、电击法、脂质体法、显微注入法、逆转
录病毒介导法等 ②转基因技术（生殖细胞） 10、常用培养细胞的生物学活性检测方法有哪些？
1）细胞计数
2）细胞活性的检查
3）细胞生长曲线
4）细胞克隆形成试验
5）软琼脂集落形成试验 11、常用哪些方法检测培养细胞的核酸及蛋白质？
（1） DNA检测方法：聚合酶链反应（PCR）、Southern Blot、基因长 度多态性（RFLP）检测;
2)RNA 检测方法： RT-PCR、Northern Blot；
ELISA 、荧光抗体法、组化法 12、简述 MTT 试验原理、试验步骤及应用。
试验原理 ：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干 水的蓝紫色甲 攒颗粒（formaza n）,并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲 基亚砜（ DMSO ）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅 与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定 OD值 试验步骤：（1）单细胞悬液接种于
96 孔培养板; 103-104细胞/孔，每 孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37C、5%
CO2 培养箱中培养一段时间
2）加入 2毫克／毫升的 MTT 液（50 微升／孔）;继续培养 3小时。
3）吸出孔内培养液后， 加入 DMSO 液（150微升／孔），将培养板 置于微孔板振荡器上振荡 10分钟，使结晶物溶解。
（4）酶标仪检测各孔OD（570nm）,记录结果。
5）绘制曲线：以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制生长曲线。
应用： MTT 法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试 验、肿瘤放射敏感性实验等 13、简述软琼脂法细胞克隆形成实验的步骤及应用。
1）用蒸馏水分别制备出%和%两个浓度的低溶点琼脂糖,高压灭 菌后，维持在40C中不会凝固。
2）取对数生长期细胞， ％胰酶消化并轻轻吹打， 使之成为单细胞， 作做细胞计数，用 20％胎牛血清的 DMEM 培养液调整细胞密度至 1
X 106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
（3）按1:1比例使％的琼脂糖和2X DMEM培养基混合后，取3ml 混合液注入直径6cm平皿中（10cm平皿中加7~10ml）,冷却凝固, 可作底层琼脂，置 CO2 温箱中备用。
4）按 1: 1 比例让％的琼脂糖和 2X DMEM 培养基在无菌试管中相 混以后，再向管中加入的细胞悬液，充分混匀，注入铺有％的琼脂糖 底层平皿中，逐渐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37C、5% 3）蛋白质检测方法：细胞内蛋白质含量的测定、 Western Blot 、 CO2 温箱中培养 10~14 天。
5）把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。
应用:常用于检测肿瘤细胞和转化细胞系
