作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(8): 1417−1423 http://www.chinacrops.org/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
基金项目: 国家自然科学基金项目(30300215, 30300220); 国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2005CB120804) 作者简介: 韦存虚(1973–), 男, 安徽临泉人, 博士, 副教授, 从事植物细胞结构与功能研究。 * 通讯作者(Corresponding author): 严长杰。 Received(收稿日期): 2007-12-27; Accepted(接受日期): 2008-03-28.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01417
水稻脆性突变体叶的解剖结构和化学特性
韦存虚1 谢佩松1 周卫东2 陈义芳2 严长杰3,*
(1 扬州大学生物科学与技术学院; 2 扬州大学测试中心; 3 教育部植物功能基因组学重点实验室/江苏省作物遗传生理重点实验室, 江苏扬州225009)
摘 要: 植物机械强度是一个十分重要的农艺性状, 为了解作物控制机械强度的机制, 本文对一个水稻脆性突变体
[bc7(t)]叶进行了细胞学观察及叶细胞化学组成分析。光镜和电镜观察都发现突变体厚壁细胞的细胞壁变薄; 对细胞
壁成分的化学分析显示突变体纤维素含量明显低于对照, 硅含量明显升高, 而木质素变化不明显; 木质素的组化反
应也显示了木质素在突变体和对照之间差异不大; X-射线微区分析表明, 硅元素在突变体叶表面明显提高。上述结果
表明, 突变体叶纤维素含量的降低影响了厚壁细胞次生壁的形成, 导致细胞壁变薄, 机械强度降低, 硅含量的升高
有助于突变体增强机械强度。
关键词: 水稻; 脆性突变体; 叶; 纤维素; 硅
Anatomical Structure and Chemical Features of Leaf in Brittle Mutant of
Rice
WEI Cun-Xu1, XIE Pei-Song1, ZHOU Wei-Dong2, CHEN Yi-Fang2, and YAN Chang-Jie3,*
(1 College of Bioscience and Biotechnology; 2 Analytical Centre; 3 Key Laboratory of Plant Functional Genomics, Ministry of Education / Jiangsu Key Laboratory for Crop Genetics and Physiology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China)
Abstract: Plant mechanical strength is an important agronomic trait. A rice brittle mutant bc7(t) which derived from japonica variety Zhonghua 11 by radiation of 60Co-γ displayed normal phenotype similar to its wild type (WT) plants except for the fragi- lity of all plant body. To understand the mechanism of controlling plant mechanical strength, the anatomical structure and chemical features of leaf of brittle mutant bc7(t) were investigated. Anatomical analyses were carried out by means of various microscopic techniques, such as light microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. It was found that the cell walls of sclerenchyma cells of leaf sheath and leaf blade in the mutant were thinner than that in WT. For histochemical loca- lization of lignin, fresh freezing-cut transverse sections of leaf blade and sheath were stained with Wiesner reagents. Responding to the Wiesner reaction, the sclerenchyma cells below the epidermis, vascular bundle sheath and xylem were stained red. Though no noticeable staining difference in leaf blade between WT and mutant, the sclerenchyma cells of leaf sheath of mutant were stained slightly deeper than that of WT. Separation and purification of cell wall of leaf blade and sheath were carried out. The lignin content of cell wall was determined by thioglycollic acid method, the results revealed a slightly higher lignin content in mutant than in WT without significant difference. The cellulose content of cell wall was assayed with the anthrone reagent; the results showed that the amount of cellulose of leaf blade and sheath in mutant was significantly lower than that in WT. The test of silicon content of cell wall showed an increased content in the mutant. The energy dispersive X-ray micro-analysis attached to the FE-SEM provided the information on the distribution and content of silicon in the epidermal cells of leaf blade and sheath. The X-ray map analysis at the upper and lower epidermis of leaf blade and outer epidermis of leaf sheath showed that the content of silicon in mutant was obvious higher than that in WT. The result from silicon X-ray mapping of upper epidermis of leaf blade indicated that the distribution of silicon was concentrated in cell wall of silica cells. X-ray point analysis on the upper epidermis of leaf blade in the cell walls of silica cell, dork cell, long cell, and bulliform cell showed that the contents of silicon at these locations in mutant were all higher than these in WT. These results suggested that the reduction of cellulose might affect the formation of 1418 作 物 学 报 第34卷
secondary cell walls, the thickness of cell wall and plant mechanical strength. Mutant might have a mechanism to balance the mechanical strength with an increase in silicon content. Keywords: Rice; Brittle mutant; Leaf; Cellulose; Silicon
植物机械强度是重要的农艺性状, 直接关系着
作物的产量和质量。脆性突变是植物中一类较为常
见的突变类型, 一方面导致作物机械强度降低, 影
响植物的抗倒伏性; 另一方面, 具有纤维素含量降
低、营养成分改变和脆性增加等特点, 使其有望发
展成为一种新型的饲料资源[1-11]。因此, 对植物脆性
突变体的深入研究具有重要的理论和实际意义。目
前脆性突变在拟南芥、大麦、小麦、玉米和水稻等
植物中均有报道, 研究主要集中在遗传分析, 确定
突变的显隐性关系、突变基因的数目和相关基因的
染色体定位等方面[1-10]。也有不少研究表明, 植物脆
性与纤维素和木质素的含量有重要关系[1-3,7-9]。由于
植物脆性性状的表现涉及到复杂的生理、生化过程,
控制细胞壁成分含量以及机械强度的机制是很复杂
的, 任何一种成分含量的变化都能够影响细胞壁成
分的变化, 一些调节因子的变化也能很明显地影响
细胞壁, 所以不同途径产生的不同突变体可能在脆
性机制上并不相同, 对这些突变体进行研究, 有助
于了解植物控制机械强度的机制, 从而为提高作物
抗倒伏性育种工作, 或选育降解率高的谷草兼用型
作物品种提供理论依据。严长杰等利用60Co-γ射线诱变
粳稻品种中花11得到一脆性突变体, 命名为bc7(t),
其表型与野生型品种相似, 但整个植株都变脆; 遗
传分析表明该突变体性状受控于单隐性基因, 该基
因是位于第1染色体长臂的一个编码纤维素合酶催
化亚基基因OsCesA4的等位基因; 在突变体中该基
因的第10个外显子和第10个内含子的连接处缺失
了7个碱基, 导致阅读框改变而不能编码功能正常
的蛋白[12]。本文分析了bc7(t)突变体叶的解剖结构和
细胞壁成分, 以及硅在突变体叶中的分布和含量变
化, 为植物脆性突变体研究积累了资料。
1 材料与方法
1.1 实验材料 以60Co-γ射线辐照粳稻品种中花11 (Zhonghua 11,
japonica variety)的干种子, 在M2代得到脆性突变体[bc7(t)], 经过连续多代自交种植, 确认该突变体性状
能稳定遗传, 非脆性材料为对照中花11[12]。凭手感可
以判断突变体植物茎、叶鞘和叶等变得非常脆。脆
性突变体和亲本均按常规栽培方法种植于扬州大学
同一块实验田, 于灌浆期取水稻穗下第2节叶鞘和叶片进行实验分析。
1.2 叶的组织解剖观察
取叶片和叶鞘中部的组织为材料, 采取常规透
射电镜制样法, 进行树脂包埋。用玻璃刀在超薄切
片机(Leica EM UC6)上切取1 μm厚的树脂半薄切片,
甲苯胺蓝染色后光镜观察与拍照; 钻石刀切取70 nm厚的树脂超薄切片, 醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重
染色后透射电镜(Philips Tecnai 12)观察与拍照。
利用冰冻切片机(Leica CM1100), 在−15℃对叶片和叶鞘中部进行冰冻切片, 厚度20 μm, 一部分用于木质素显微化学定位, 另一部分将切片粘在盖玻片上, 干燥器中干燥, 用双面胶带将盖玻片粘在样品台上, 离子溅射仪镀金膜, 扫描电镜(Philips XL-30 ESEM)下观察与拍照。
1.3 木质素显微化学定位
参考Wiesner反应法[13]进行木质素显微化学染色定位。将20 μm厚的冰冻切片先在2%的间苯三酚溶液中孵育2 min (间苯三酚溶于95%酒精溶液中), 再用50%盐酸封片, 光学显微镜观察并拍照。 1.4 细胞壁成分的分离提纯
参考Turner等的方法[1]分离提纯细胞壁成分。将
水稻叶片和叶鞘在液氮中速冻后研磨, 研磨得到的
粉末经70%酒精在70℃条件下萃取3次, 每次1 h,
所得残渣于50℃烘干至恒重。
1.5 纤维素含量测定
参考Updegraff的方法[14]测定纤维素含量。取分
离的细胞壁粉末100 mg, 加67%硫酸(V/V)溶解纤维
素及蒽酮溶液, 置沸水浴16 min, 冰浴10 min, 室温5 min。用分光光度计测定620 nm处溶液的吸光值。
实验重复3次。
1.6 木质素含量测定
参考巯基乙酸法[5]测定木质素含量。取分离的
细胞壁粉末15 mg, 放入2.5 mL离心管, 加0.3 mL
巯基乙酸及1.5 mL 2 mol L−1 HCl, 95℃下水解4 h。
冷却到室温, 15 000×g离心15 min, 水洗3次, 留沉
淀。将沉淀在1.5 mL 0.5 mol L−1的NaOH中处理16 h, 20℃下振荡提取木质素巯基乙酸 (lignothioglycolic
acid, LTGA)。15 000×g离心15 min后获得上清液, 以
2 mL水洗2次, 分别离心。合并上清液, 放入离心管,
加0.4 mL浓盐酸, 混匀, 4℃放置4 h, 沉淀LTGA, 15 000×g离心20 min, 留沉淀。将沉淀溶解在1 mL 0.5
