农业环境科学学报２００７，２６（２）：４６７－４７１ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｏ－ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ
摘要：从含铬污水、活性污泥和铬污染土壤中分离出６株硫酸盐还原菌（ｓｕｌｐｈａｔｅ－ｒｅｄｕｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ，简称ＳＲＢ），并对它们进行了还原Ｃｒ（Ⅵ）能力的验证试验，研究了利用其中２株菌（Ｗｎ－１和Ｗｓ－２）修复Ｃｒ（Ⅵ）污染土壤的效果。结果表明，分离获得的６株ＳＲＢ都具有还原Ｃｒ（Ⅵ）能力，综合分析３个不同初始Ｃｒ（Ⅵ）浓度的Ｃｒ（Ⅵ）转化率，Ｗｎ－１和Ｗｓ－２的还原Ｃｒ（Ⅵ）能力较强，其次为Ｗｓ－１和Ｗｎ－２，而Ｔｊ和Ｔｇ较弱，即从电镀厂污水处理厂污水和活性污泥中分离的菌株Ｃｒ（Ⅵ）还原能力较强，而从电镀厂附近土壤和基地铬污染土壤中分离的菌株Ｃｒ（Ⅵ）还原能力较差；初始Ｃｒ（Ⅵ）浓度过高会抑制硫酸盐还原菌的还原能力；菌株Ｗｎ－１和Ｗｓ－２都能很好地修复Ｃｒ（Ⅵ）污染土壤，但它们的混合菌液修复效果更佳，１０ｄ后Ｃｒ（Ⅵ）的转化率达７５．３％；菌株Ｗｎ－１和Ｗｓ－２经初步鉴定为脱硫弧菌。关键词：铬（Ⅵ）污染；生物修复；硫酸盐还原菌；土壤中图分类号：Ｘ５３文献标识码：Ａ文章编号：１６７２－２０４３（２００７）０２－０４６７－０５
收稿日期：２００６－１０－１７基金项目：上海市农委攻关项目（沪农科攻字（２００３）第１０－５号）作者简介：吴淑杭（１９７０—），男，副研究员，博士研究生，主要从事有机废弃物资源化、污染控制微生物工程等领域的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｕｓｈｕｈａｎｇ８８＠１６３．ｃｏｍ由于在工业中大量使用铬及其化合物，使得受铬污染的土壤越来越多。近年来有研究发现，不少细菌产生的特殊酶能还原重金属，从而降低重金属的毒性。比如Ｃｒ（Ⅵ）是可以采用Ｃｒ（Ⅵ）还原菌修复技术来处理的污染物。如ＤｅｓｊａｒｄｉｎＶ．等对法国Ｒｈｏｎｅ－Ａｌｐｅｓ地区的被污染土壤中微生物的活性对铬化学状态的影响进行了研究，将可以降低Ｃｒ（Ⅵ）的链霉菌ｔｈｅｒ－ｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｕｓ菌株从被污染的土壤中分离出来进行研究，发现该菌株可以将Ｃｒ（Ⅵ）固定，其固定形式与外生的接种体假单细胞荧光ＬＢ３００相类似，都是将硫酸盐还原菌修复铬（Ⅵ）污染土壤研究
吴淑杭１，２，周德平１，吕卫光１，姜震方１，徐亚同２（１．上海市农业科学院环境科学研究所，上海２０１１０６；２．华东师范大学环境科学系，上海２０００６３）
ＲｅｍｅｄｉａｔｉｏｎｏｆＨｅｘａｖａｌｅｎｔＣｈｒｏｍｉｕｍ－ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄＳｏｉｌｂｙＳｕｌｐｈａｔｅ－ＲｅｄｕｃｉｎｇＢａｃｔｅｒｉａＷＵＳｈｕ－ｈａｎｇ１，２，ＺＨＯＵＤｅ－ｐｉｎｇ１，ＬＵＷｅｉ－ｇｕａｎｇ１，ＪＩＡＮＧＺｈｅｎ－ｆａｎｇ１，ＸＵＹａ－ｔｏｎｇ２（１．ＥｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＳｈａｎｇｈａｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１１０６，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎｖｉ－ｒｏｎｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，ＥａｓｔＣｈｉｎａＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００６３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｅｒｅｃｏｎｄｕｃｔｅｄｔｏｄｅｏｘｉｄｉｚｅＣｒ（Ⅵ）ｕｓｉｎｇＳＲＢ（ｓｕｌｐｈａｔｅ－ｒｅｄｕｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ）ｓｅｐａｒａｔｅｄｆｒｏｍｃｈｒｏｍｉｕｍ－ｐｏｌｌｕｔｅｄｗａｓｔｅｗａｔｅｒ，ｓｏｉｌａｎｄａｃｔｉｖａｔｅｄｓｌｕｄｇｅ．Ｔｈｅｒｅｐａｉｒｉｎｇｅｆｆｅｃｔｔｏｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ－ｓｏｉｌｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｕｓｉｎｇｔｗｏｓｔｒａｉｎｓ（Ｗｎ－１ａｎｄＷｓ－２）ａｍｏｎｇｔｈｅｓｉｘｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅｓｉｘｂａｃｔｅｒｉａｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅａｌｌｃａｐａｂｌｅｏｆｓｕｌｐｈａｔｅ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ．ＷｈｅｎｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＣｒ（Ⅵ）ｗａｓ５０ｍｇ・Ｌ－１，ｆｏｕｒｓｔｒａｉｎｓ（Ｗｎ－１，Ｗｓ－２，Ｗｓ－１ａｎｄＷｎ－２）ｅｘｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｓｔｒｏｎｇｅｓｔｄｅｏｘｉｄｉｚａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｒｅａｃｈｅｄ１００％ａｆｔｅｒ３ｄａｙｓ；ｗｈｉｌｅａｔ１００ｍｇ・Ｌ－１ｏｆＣｒ（Ⅵ），Ｗｎ－１ｅｘｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｓｔｒｏｎｇｅｓｔｄｅｏｘｉｄｉｚａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙ，ｗｉｔｈｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅ５７．３％３ｄａｙｓｌａｔｅｒ．Ｗｈｅｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｒｅａｃｈｅｄ２００ｍｇ・Ｌ－１ｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＷｎ－１ｗａｓｕｐｔｏ２３．１％，ｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆＷｓ－２ａｎｄＷｓ－１，ｂｅｉｎｇ１５．６％ａｎｄ１３．６％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｗｎ－１ａｎｄＷｓ－２ｓｅｐａｒａｔｅｄｆｒｏｍｗａｓｔｅｗａｔｅｒａｎｄａｃｔｉｖａｔｅｄｓｌｕｄｇｅｏｆｅｌｅｃｔｒｏｐｌａｔｅｆａｃｔｏｒｙ＇ｓｗａｓｔｅｗａ－ｔｅｒｐｌａｎｔｓｐｏｓｓｅｓｓｅｄｔｈｅｂｅｓｔｄｅｏｘｉｄｉｚａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙ，ｓｕｐｅｒｉｏｒｔｏＷｓ－１ａｎｄＷｎ－２，ｗｈｉｌｅｔｈｅｗｅａｋｅｓｔｗｅｒｅＴｊａｎｄＴｇｓｅｐａｒａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓｏｉｌｏｆｅｌｅｃｔｒｏｐｌａｔｅｆａｃｔｏｒｙ．ＥｘｏｒｂｉｔａｎｔｐｒｉｍａｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＣｒ（Ⅵ）ｃｏｕｌｄｒｅｓｔｒａｉｎｔｈｅｄｅｏｘｉｄｉｚａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆＳＲＢ．Ｔｈｅｒｅｐａｉｒｉｎｇｅｆｆｅｃｔｔｏｃｏｎｔａｍ－ｉｎａｔｅｄｓｏｉｌｃａｎｂｅｉｍｐｒｏｖｅｄｕｐｔｏ７５．３％ａｆｔｅｒ１０ｄａｙｓｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｍｉｘｅｄＷｎ－１ａｎｄＷｓ－２，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＷｎ－１ａｎｄＷｓ－２ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｗｎ－１ａｎｄＷｓ－２ｗｅｒｅｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＤｅｓｕｌｐｈｏｖｉｂｒｉｏｓｐ．．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｈｅｘａｖａｌｅｎｔｃｈｒｏｍｉｕｍ－ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ；ｂｉｏ－ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ；ｓｕｌｐｈａｔｅ－ｒｅｄｕｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ；ｓｏｉｌ２００７年３月铬沉降为类似于Ｙ－Ｃｒ００Ｈ结构的铬的羟基氧化物［１］。韩怀芬等通过土壤与含铬的培养基一起培养，筛选出５种能还原Ｃｒ（Ⅵ）的菌种，经鉴定分别为产碱杆菌、土壤杆菌、芽孢杆菌、葡糖杆菌和假单胞菌，并用这些菌种处理铬污染土壤有很好的效果［２］。瞿建国等从土壤中分离筛选出几株抗Ｃｒ（Ⅵ）的硫酸盐还原菌（ｓｕｌ－ｐｈａｔｅ－ｒｅｄｕｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ，缩写为ＳＲＢ），能在含８００ｍｇ・Ｌ－１Ｃｒ（Ⅵ）的培养基中生长，其中２－ｓ－８菌株在含７５ｍｇ・Ｌ－１Ｃｒ（Ⅵ）的培养基中生长３６ｈ后，培养液中的Ｃｒ（Ⅵ）已全部消失［３］。通过比较已有的Ｃｒ（Ⅵ）还原菌，发现硫酸盐还原菌最具潜力［４］。对于运用ＳＲＢ修复铬污染环境，目前把水溶液中的Ｃｒ（Ⅵ）还原为Ｃｒ（Ⅲ）的研究较多，而针对Ｃｒ（Ⅵ）污染土壤，利用ＳＲＢ的生物还原作用将Ｃｒ（Ⅵ）还原成Ｃｒ（Ⅲ），以降低铬的植物有效性和生物毒性的生物修复技术研究报道较少［５、６］。本研究针对上海某黄桃基地因曾施用皮革废料有机肥致使土壤轻度铬污染而造成黄桃铬含量微量超标（经有关部门检测，该基地生产的黄桃中Ｃｒ含量为０．６２ｍｇ・ｋｇ－１，而国家标准———农产品安全质量无公害水果安全要求（ＧＢ１８４０６．２—２００１）中要求总铬含量≤０．５ｍｇ・ｋｇ－１。），进行了硫酸盐还原菌分离筛选及还原Ｃｒ（Ⅵ）效果验证，研究了利用ＳＲＢ转化污染土壤中Ｃｒ（Ⅵ）为Ｃｒ（Ⅲ）的效果，以降低土壤中铬的植物有效性和毒性，为土壤受轻度铬污染的黄桃生产基地安全生产提供一项有效措施。１材料与方法１．１试验材料１．１．１菌株分离源上海市某电镀厂污水（简称：Ｗｓ；总铬含量：１８１３．４ｍｇ・Ｌ－１）及其处理厂的活性污泥（简称：Ｗｎ；总铬含量：１４５８２．８ｍｇ・Ｌ－１）、某电镀厂附近土壤（简称：Ｔｇ；总铬含量：３４２．４ｍｇ・Ｌ－１）和上海某黄桃基地铬污染土壤（简称：Ｔｊ；总铬含量：１１０．７ｍｇ・Ｌ－１）。１．１．２Ｃｒ（Ⅵ）样品分析纯Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７。１．１．３土壤样品上海市农业科学院试验场水稻土。供试土样（０￣２０ｃｍ）风干后过２ｍｍ尼龙筛备用。土壤基本性质如下：ｐＨ７．３０，有机质２６．３ｇ・ｋｇ－１，全氮２．２５ｇ・ｋｇ－１，全磷０．７５ｇ・ｋｇ－１，全钾１７．４ｇ・ｋｇ－１，铬（Ⅵ）５．１ｍｇ・ｋｇ－１。１．１．４培养基培养基１：蛋白胨１０．０ｇ・Ｌ－１，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２．０ｇ・Ｌ－１，Ｎａ２ＳＯ３０．５ｇ・Ｌ－１，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ・Ｌ－１，柠檬酸铁０．５ｇ・Ｌ－１，乳酸钠０．５ｇ・Ｌ－１，１％巯基醋酸钠１０ｍＬ，１％抗坏血酸钠１０ｍＬ，加入蒸馏水１Ｌ，调节ｐＨ至７．５左右。在１２１℃、０．１１ＭＰａ高压灭菌２０ｍｉｎ，冷却后备用。巯基醋酸钠和抗坏血酸钠预先配成１％的溶液并经过高压灭菌，使用前按上述量加入［６］。培养基２：ＮａＨ２ＰＯ４１．２ｇ・Ｌ－１，ＫＨ２ＰＯ４１．８ｇ・Ｌ－１，Ｎａ２ＳＯ４４．０ｇ・Ｌ－１，ＮＨ４Ｃｌ１．０ｇ・Ｌ－１，ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ０．０５ｇ・Ｌ－１，乳酸钠３．５ｍＬ，１∶１柠檬酸钠－ＦｅＣｌ２溶液（０．５ｇ・Ｌ－１）１．０ｍＬ，酵母浸膏１．０ｇ・Ｌ－１，蒸馏水１０００ｍＬ，调节ｐＨ至７．５。经１２１℃、０．１１ＭＰａ高压灭菌２０ｍｉｎ，冷却后备用［７］。１．２试验方法１．２．１硫酸盐还原菌的富集、驯化和分离方法菌种富集：对于土样和污泥，称２．０ｇ置于无菌试管中，再加入９．０ｍＬ０．８５％的生理盐水，制成１０－１的稀释液，吸取２．０ｍＬ这样的稀释液加入１３０ｍＬ血清瓶中，而对于污水则先吸取５．０ｍＬ原样，再用新鲜培养基１注满该血清瓶，并置于３０℃培养箱中培养至产出极浓的黑色沉淀（ＦｅＳ）。在培养过程中对培养物中的菌体进行镜检，如果发现弧菌或杆菌已成优势种，则可认为该富集物已基本上是硫酸盐还原菌为主；如果不是，则将黑色富集物转接至新鲜培养基中，接种量为１０％，直至镜检发现弧菌或杆菌已成优势种［７］。菌种驯化：将富集菌液，以１０％接种量接到装有培养基１的螺口试管中，同时加入一定浓度的Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７在３０℃培养箱中驯化培养。最初加入的Ｃｒ（Ⅵ）浓度为５０ｍｇ・Ｌ－１，以后依次以５０ｍｇ・Ｌ－１梯度递增，待试管中菌体明显长出后，取出一部分进行转接，直到最后的Ｃｒ（Ⅵ）浓度为２００ｍｇ・Ｌ－１［６、８］。菌种分离与纯化：采用二重皿法。将培养皿的上盖和内皿向同一方向撂起来，外盖在下。灭菌后并列于无菌室内的桌上，把内皿提起架在外盖的边缘上，在内外盖的空隙里加入驯化菌液０．５ｍＬ，然后注入２０ｍＬ溶解且保温在４５℃左右的琼脂培养基１，固化后置于３０℃培养箱中培养至长出完整的黑色菌落［７］。１．２．２菌株的初步鉴定菌体染色及形态观察：采用培养基１接种待测菌株，将处于对数生长期的菌体进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌株的革兰氏染色结果及细菌形态。脱硫绿啶（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｒｉｄｉｎ）的定性检查：脱硫绿啶属于亚硫酸盐还原酶中的一种，可以通过以下方法检吴淑杭等：硫酸盐还原菌修复铬（Ⅵ）污染土壤研究４６８
