第五组 含量测定——咖啡因的原料与制剂（包括复方制剂）
翁琦、黄璐斐
题目：高效液相色谱法、红外光谱法、紫外光谱法、碘量法测定咖啡因的含量
1.拟定方法的理论依据
N N
N N 3H 3C
O
O CH 3
（1） 高效液相色谱法的原理：是以液体作为流动相的色谱法，它是利用样品
中各组分在色谱柱中固定相和流动相相间分配系数或吸附系数的差异。将各组分分离后进行定性、定量分析。本实验以咖啡因为测定对象，以反相HPLC 来分离检测药物中咖啡因的含量。
（2） 红外光谱的原理：选择咖啡因中不受干扰的特征吸收峰羰基峰和铁氰化钾中的特征吸收峰氰基峰，通过咖啡因特征峰吸光度与铁氰化钾特征峰的吸光度的峰高之比与其对应浓度进行线性回归分析，从而获得标准工作曲线．用相同方法对待测咖啡因样品进行测定，通过标准曲线获得待测咖啡因的浓度．
（3） 紫外光谱法的原理：利用咖啡因结构上的嘌呤环具有共轭双键体系 ,咖啡
因的三氯甲烷溶液在276.5nm 下有最大吸收，其吸收值的大小与咖啡因的浓度成正比，从而可进行定量测定。
（4） 碘量法的原理：咖啡因是生物碱，但碱性极弱，1%的水溶液 pH 为6.9，
一般生物碱的含量测定方法均不适用；但咖啡因可在酸性条件下与碘定量生成沉淀，可采用剩余碘量法测定其含量。
2.所用仪器及试剂
（1）C 一10A T 型高效液相色谱仪、A B265 一S 型电子天平。 咖啡因对照品；z b JL 氨酚烷胺颗粒乙腈为色谱纯 ， 所用试剂均 为分析纯 ， 试验用水为二次蒸馏水。
（2）傅立 叶 变 换 红 外 光 谱 仪 : FT - IR , NEXUS - 870; 高 效 液 相 色 谱 仪; 电子天平。铁氰化钾 (AR ) ,溴化钾 (AR ) ,咖啡因标样 (纯度大于 99. 9% ) 。
（3）T u 1901 双光束紫外可见分光光度计； 电子天平； 常压 干燥 箱 ； 超声 波清洗 器； D T 5— 6A 型离心机 。
苯，乙酸乙酯，二氯甲烷，三氯甲烷均为市售分析纯试剂；咖啡因(分析纯，武汉恒通化工有限公司); 各种可乐饮料
（4）滴定管，移液管，锥形瓶，研钵，容量瓶。APC复方制剂，碘滴定液，稀硫酸，硫代硫酸钠
3.实验步骤
（1）高效液相色谱法
取样品片, 精密称定, 研细, 精密称取适量（约相当于对乙酞氨基酚100mg）, 置200ml量瓶中, 加流动相约100ml, 振摇使溶解, 并加流动相稀释至刻度, 摇匀, 滤过, 取续滤液5.0ml，置25ml量瓶中, 加流动相稀释至刻度, 摇匀,作为供试品溶液。取供试品溶液林, 注人液相色谱仪, 记录色谱图。另精密称取对照品对乙酞氨基酚、乙酞水杨酸及咖啡因各适量, 置同一量瓶中,加流动相制成与供试品溶液相同浓度的对照品溶液, 同法测定, 按外标法以峰面积计算成分含量
（2）红外光谱法
样品的前处理：溴化钾和铁氰化钾在进行测定前要进行干燥处理,待测的咖啡因是通过茶叶研磨成碎末然后用乙醇作溶剂在索氏提取器中进行回流萃取,得到粗产品用于分析测定.
标准曲线绘制：在电子天平上,准确称取6份KBr0.08g和内标物0.01g,分别
称取咖啡因标样按1.0mg、3.7mg、7.1mg、10.0mg、 16.0mg、 27.7mg(准确到±0.0002g)置于玛瑙研钵中,充分研磨,注意研磨过程中不要让样品损失.充分混合均匀后控制一定的压力进行制样,绘制混合样品的红外光谱吸收谱图,对每一个混合样品均进行3次测定,测定其平均值。
（3）紫外光谱法
【样品处理】样品的处理在250mL的分液漏斗中，准确移入l0.0mL经超声脱气后的均匀可乐型饮料试样，加入1.5%高锰酸钾溶液5mL，摇匀，静置于
5min，加入混合溶液10mL，摇匀，加入30mL重蒸三氯甲烷。振摇100镒，静止分层，收集三氯甲烷。水层再加入10mL重蒸三氯甲烷，振摇100次，静置分层。合并二次三氯甲烷萃取液，并用重蒸三氯甲烷定容至100mL，摇匀，备用。在25mL巨塞试管中，加入5g无水硫酸钠，倒入20mL样品的三氯甲烷制备液，摇匀，静置。将澄清的三氯甲烷用1cm比色杯于276.5nm处测其吸光度，根据标准曲线求出样品的吸光度相当于咖啡因的浓度。测定时用重蒸三氯甲烷作试剂空白。
（4）碘量法
取本品20片，精密称定，研细备用。精密称取适量细粉 (约相当于咖啡因
50mg)，加稀硫酸5ml ，振摇数分钟溶解后，滤过，滤液置50ml容量瓶中，滤器与滤渣洗涤三次，每次5ml，合并滤液与洗液，精密加碘滴定液 (0.1mol/L) 25ml，用水稀释至刻度，摇匀。在25 ℃避光放置15分钟，滤过，精密量取续
滤液25ml，置碘量瓶中，用硫代硫酸钠滴定液(0.05mol/L) 滴定，至近终点时，加淀粉指示液，滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正，即得。
4.实验结果的计算式
（1）高效液相色谱法
线性范围分别为19.93~199.32μg/ml,36.00~359.96μg/ml,4.90~49.04μg/ml；平均回收率（n=9）分别为99.2%，99.7%，98.8%
（2）红外光谱法
方法的线性范围为10~250mg/g，其线性回归系数r=0.9953；采用该方法对样品进行测定的结果与HPLC方法比较获得了满意的结果；回收实验中平均回收率为98.0%~100.5%
（3）紫外光谱
观察咖啡因的标准曲线可知随着咖啡因含量的增加，其在最大吸收波长处的吸光度也逐渐增加，呈现较好的线性关系．线性方程为： Y=0．031 74+ 0．050 62 X ．相关系数 r =0． 999 7．
（4）碘量法
5.参考文献
（1）高效液相色谱法
[1】孙桂荣，卢华伟，潘舒平．HPLC 测定氨咖麻敏胶囊中各组分的含量中国药学杂志， 2004 ， 39(7)： 524 —544．
[2】国家药典委员会．国家药品标准·化学药品地方标准上升国家标准(第三册)【 M 】．北京：化学工业出版社， 2002： 263．
[3】张帆．RP —H PLC 法测定复方氨酚烷胺胶囊中对乙酰氨基酚和咖啡因含量【 J】．海峡药学， 200 7 ， 19(5) ： 4 1 — 42．
