Lipofectamine 2000 转染试剂转染步骤(24孔板 /6孔板 :
一 :瞬时转染 (贴壁细胞
1. 转染前一天,胰酶消化细胞并计数,细胞铺板在500 μl/2ml含血清,不含抗生
素的正常生长的培养基中 (每孔 0.5-2×105 /3×105 胞。使其在转染日能达到90-95%的融合。
2. 对于每孔细胞,使用 50ul/250 ul无血清培养基(如 OPTI-MEM I培养基稀释0.8ugDNA/ 4.0ugDNA, 轻轻混匀。
3. 使用前将 Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀,每孔细胞用 50ul/250 ul无血清培养基(如 OPTI-MEM I培养基稀释 2ul/10ul Lipofectamine 2000转染试剂 . 轻轻混匀 , 室温孵育 5分钟。
NOTE :Lipofectamine 2000稀释后, 在 5分钟后同稀释的 DNA 混合 (<30分钟。长时间孵育会降低活性 . 若使用 DMEM 培养基稀释, 则需在 5分钟内同稀释的 DNA 混合。
4. 混合稀释的 DNA (第二步和稀释的 Lipofectamine 2000(第三步 , 此时总体积是 100 ul/ 500ul 。轻轻混匀 , 室温放置 20分钟以使 DNA- Lipofectamine 2000复合物形成。溶液可能会比较浑浊 , 但这不影响转染效率 . DNA- Lipofectamine 2000复合物室温放置 6小时都比较稳定 .
5. (optional 将 24孔板中的旧营养液吸出,用无血清培养基清洗两次。加入
0.5ml/2ml无血清配养基。
6. 逐滴加入 100 ul/500ul 脂质体 /DNA混合物到每孔中(从培养孔一边到另一边,边加边前后来回摇动培养板,轻轻混匀。
7. 在 37℃, 5%CO
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中孵育 24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。或者在 4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。
8. 在细胞中加入复合物 24-72小时后, 荧光镜下观察转染效率 , 分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测各项指标。这依赖于细胞类型和启动子活性。
二 :稳定转染 (贴壁细胞
1-7:同瞬时转染 .
8:转染 24h 后施加筛选压力,改用含 G418的培养基培养。在 G418筛选浓度下持续培养 14天后,挑出单克隆,扩大培养 . 期间每 3天换液一次 .
Invitrogen 公司推荐的贴壁细胞的稳定转染:转染后 24小时 , 将细胞以≥ 1:10
的比例传代至新鲜培养基中,次日加入选择性培养基。
9: 检测各项指标 .
转染注意事项 :
1:优化转染条件(脂质体的用量、 DNA 密度、细胞密度、脂质体和 DNA 混合孵育时间每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染, 所用溶液滤过灭菌, 以及随后的使用应在无菌条件下, 这是细胞惯常的做法。但是,脂质体以及脂质体 / DNA混合物无需滤过除菌。
2:预备脂质体 /DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体 / DNA 与被转染细胞共孵育的过程中,血清又是培养基的一部分。
3:在转染之前更换培养基,可提高转染效率,但所用培养基必须 37℃预温。 4: 脂质体 / DNA混合物应当逐滴加入,尽可能保持一致,从培养皿一边到另一边,边加入边轻摇培养皿,以确保均匀分布和避免局部高浓度。
