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毕赤酵母表达知识归纳1a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。
b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。
说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。
Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。
过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。
然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。
4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。
该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。
都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。
invitrogen手册上可以灭菌的。
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1。
挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250—300r/min 培养过夜；2. 取100-500µl （≤1：100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250—300r/min培养过夜(约20h）,至OD600 达到1.3～1。
5;3。
将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4。
按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5。
按步骤3 离心,用2—5ml,1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6。
按步骤3 离心，用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul；备注:可将其分装为80 µl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。
比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。
对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。
一般对于甲醇诱导菌株,摇瓶一天左右后开始补加甲醇,就类似BMMY的功能了。
✓KM71比GS115生长的要慢。
毕赤酵母都应该是白色菌落的✓对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性？菌种保存：挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1：1加入30％灭菌甘油，—80o C ul/管冻存（一般用10ug以上质粒用SalI酶切,然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O 重溶。
转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。
建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
乙醇沉淀主要步骤如下：1)酶切体系（80ul)中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC,混匀2)—20℃20分钟沉淀3）13200rpm,20min，离心后弃上清4)75％乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清5)37 度烘箱至无乙醇气味(或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。
毕赤酵母表达的培养基配制2.1 LB(Luria-Bertani)培养基：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl l%PH 7.0制作平板时加入2%琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存。
用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。
2.2 LLB(Low Salt LB)培养基：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl 0.5%PH 7.0制作平板时加入2%琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存数月。
用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。
2.3 YPD (又称YEPD)Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基) Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100 μg/ml液体YPD培养基可常温保存;琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。
加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。
2.4 YPDS + Zeocin 培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol (山梨醇)1 M+agar 2%+ Zeocin 100 μg/ml不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。
2.5 MGYMinimal Glycerol Medium (最小甘油培养基)(34%YNB;1%甘油;4*10-5%生物素)。
**:通讯作者。
毕赤酵母表达巴曲酶发酵条件的优化研究薛雁1,2,徐梅2**,薛百忠2,王宏英2,兰海英2(11吉林大学,吉林长春130012;21辽宁诺康生物制药有限责任公司,辽宁沈阳110171)[摘要]目的对表达重组巴曲酶的巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行优化,确定最佳的发酵控制条件以获得重组巴曲酶的最高表达量。
方法通过多因素正交实验确定巴曲酶发酵培养的最适培养条件。
结果表达温度在25e,pH值为710,加入甲醇的量为10g/L时为最优发酵条件,诱导表达时间为84~96h。
结论重组巴曲酶可以开发为止血药,代替临床应用的从蛇毒中提取的巴曲酶。
[关键词]重组巴曲酶;毕赤酵母;摇瓶发酵;发酵优化[中图分类号]R97713[文献标识码]A[文章编号]1001-5639(2009)02-0094-05 Studies on Batroxobin Fermentation Conditions of the Engineered Pichia Pastoris StrainXUE Yan1,2,XU Mei2**,XUE Bai2zhong2,WANG Hong2ying2,LAN Hai2ying2 (11Jilin U niversity,Changchun,Jilin,130012,China;21Liaoning NuokangBio2pharmaceutical Co.,LT D,Shenyang,Liaoning,110171,China)Abstract:Obj ective In order to pr ovide theoretical basis for the industr ial production of ba2 tr oxobin.the batroxobin fermentation conditions of the genetic engineered Pichia pastoris strain KM71H/pPICZ A A2Bg in shake2flask wer e studied.Method s T he optimum conditions are selected by orthogonal design.Results T he optimum temperature is25e,pH is710.metha2 nol concentration is10g/L,time is84~96h.the activity of batroxobin was reached to30Ku/ ml.Conclusion Recombinant batroxobin can be developing as haemostat to take the place of clinic applied batroxobin purified from snake venom.Key words:recombinant batroxobin;Pichia p astor i;shake2flask fermentation;optimization巴曲酶(Batroxobin EC3.4.21.29)是1963年奥地利学者Von Klobusitzky首次从巴西矛头蝮蛇(Bothr op s a tr ox)毒液中分离得到的一种丝氨酸蛋白水解酶(类凝血酶)。
微生物发酵罐发酵（毕赤酵母）
灭菌前:
室温下校准PH电极，先校6.86零点再4.0斜率（若的发酵pH很长时间是酸性的（如酵母 发酵）用
6.86校正零点，4.0校正斜率；若你的发酵 pH很长时间是碱性的（如某些细菌发 酵）用6.86校正零
点，9.18校正斜率）；
室温下校准溶氧电极，1.0点在不接溶氧电极时候标定， 100%点接上溶氧电极，放置在空气
中较定；或 2.0点在灭菌过程中，温度达到 121度左右压力 0.12mpa左右时候标定，100%
在灭菌结束，降温至发酵温度并稳定， 转速在发酵初始转速， 通气量在发酵初始通气量时候
标定
灭菌：
1.
灭菌，先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至
80~90C，将排气阀逐渐关小。接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入 罐中
（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到 118~120°C，罐压维持在
0.09~0.1Mpa （表压），并保持30min左右。
2. 保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后， 向罐内通入无菌 空气，
在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度， 进行下一步的发酵 和培养。
（注意压力：灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于 0.3~0.35Mpa，使用压力不低于 0.2Mpa。）
灭菌后
:
A.消耗甘油阶段
1. 灭菌后冷却30 C时：
2. 冷却至30C时，开启搅拌（转速最大）和通气（0.1-1.0vvm）,接通28履水（未
稀 释）调PH5.0;每升加4.35ml的无菌PTM1基础盐；
3. 从摇瓶中接种种子液，DO值为100%开始培养后会消耗，导致 DO值下降， 通
氧气以确保DO值超过20%,速率先为0.1vvm。
4. 发酵过夜甘油被完全消耗（18-24h）,标志为DO值增加到100%）
【每天至少两次取样，测 OD600,湿重，显微观察.将菌体和上清（离心后）在
-80C下保藏，用于后面的分析）】
5. 这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。重组蛋白质不产生）
B甘油补料阶段
1. 将12ml/L PTM1加入50%VVM的甘油中，将补料速率设为18.15ml每小时每升
初试发酵液体积）
2. 甘油补料将进行约4h或更长。在本阶段完成后 细胞产量应达到180-220g/L湿 细
胞，但是不会有重组蛋白质的产生）
【4%甘油的是所建议的在补料中的最大水平，更高的甘油浓度将会产生毒害问
题。】
重要:如果溶氧低于 20%，应该停止甘油或甲醇的 补料并且不做任何提高溶氧的
事直到溶氧稳定。这时开始调整搅拌、通气、压力或氧气的补充。
有报道称如果培养基的 pH低于3.0,中性蛋白酶会被抑制。故如果有必要可设为 3.0保持
4-5h甘油补料阶段。
甲醇补料培养
在甲醇补料前甘油都必须消耗干净。
1.12mlPTM1基本盐类每升的100%的甲醇进行诱导。
速率为3.6ml/h每升初试发酵液体积。
开始的2-3h内甲醇会在发酵液中累积，溶氧值会有变化。
2. DO值不能维持在20%以上，停止流加甲醇，等到DO值稳定后继续以当前速 率流
加甲醇。增加搅拌、通气、压力或者氧气的 补充来使DO维持在20%以上
DO值会一直变化。
3•当培养物完全适应利用甲醇 (2-4h)并且甲醇成为其限制性生长因子后，将会 有一
个稳定的DO读数和一个较快的DO稳定时间点(通常不到1min)。在培养 物适应甲
醇后而将流加速率翻倍前在限制条件下保持这个较低的流加速率最少
4调10.9 ml/h到最后 5.—
共加入接近740ml
，约
70h。细胞浓度会最终增加
到 350-450g/L湿细胞
YPD
(100ml)
酵母膏是1g，
蛋白胨2g，
葡萄糖2g0 若固体，再加
2g琼脂粉。
自然pH值约5.4,
刚好是酵母合适 的pH
值。一般不 需要调节pH
o
1h。
然后流加速率增加一倍到约7.3ml/h每升初始发酵液体积。
(2h)
LB
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 氯化钠
(
NaCI) 10g/L
NaOH 调节 pH7.4
120 C灭菌
BMGY
酵母膏 20
蛋白胨 10
磷酸钾缓冲液(pH6.0)
YNB 13.4
Biotin 生物素 0.004
甘油 10
