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原代心肌细胞培养方法的探讨大家好呀！今天咱就来好好聊聊原代心肌细胞培养这个事儿。
这在生物医学领域那可是相当重要的一块内容呢，好多研究都得靠它。
下面咱就一起深入探讨探讨它的培养方法哈。
一、原代心肌细胞的来源。
咱得先搞清楚这原代心肌细胞从哪儿来呀。
一般来说呢，常用的来源有新生大鼠或者小鼠的心肌组织。
为啥选它们呢？因为新生的小动物心肌细胞分裂增殖能力相对比较强，更容易培养成功。
就像新生的小树苗，生命力旺盛，更容易茁壮成长嘛。
比如说新生大鼠，一般出生1 3天的就挺合适的。
这时候的心肌细胞状态好，能为后续的培养打下好基础。
二、培养前的准备工作。
这准备工作可不能马虎呀，就好比做饭前得把食材、调料啥的都准备齐全。
首先得有合适的培养器材。
像培养皿、离心管这些，都得保证无菌无污染。
想象一下，如果培养环境不干净，那细胞得多难受呀，肯定长不好。
所以培养器材得提前清洗干净，然后高温高压灭菌处理，让它们干干净净地迎接心肌细胞。
还有培养液也很关键哦。
一般要用含有血清、各种营养成分和生长因子的培养液。
血清就像是细胞的“营养餐”，能给细胞提供各种必需的营养物质。
常见的有胎牛血清，它的营养成分比较丰富，能让细胞吃得饱饱的，活力满满。
另外，培养液里还得加一些抗生素，防止细菌污染，就像是给细胞安排了保镖，保护它们的安全。
三、心肌细胞的分离。
这一步就像是把混在一起的小伙伴们一个一个分开来。
咱得把取出来的心肌组织剪成小块，然后用酶消化法把细胞分离出来。
常用的酶有胰蛋白酶和胶原酶。
胰蛋白酶就像一把小剪刀，能把细胞之间的连接剪开；胶原酶呢，则专门对付那些胶原蛋白，让细胞更容易被分离开来。
消化完之后，再通过离心的方法把细胞收集起来。
离心的时候，细胞就会像坐滑梯一样，乖乖地聚集到离心管的底部。
四、细胞的接种和培养。
细胞分离好了，接下来就是让它们在培养皿里“安家落户”啦。
把收集到的细胞用培养液稀释一下，然后均匀地接种到培养皿中。
这时候要注意细胞的密度不能太大也不能太小，太大了细胞会觉得拥挤，长不好；太小了又会觉得孤单，也不利于生长。
原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下：1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g・L1,我们使用的为0.8 g・L1.胶原酶最好现用现配.3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r・min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染.6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU 很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞.7换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g ・L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.8抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会.(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率.9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：(1) pH值会在过滤后上升0.1~0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH 上升.每次配好的培养液尽量在2 wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用.。
大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。
乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。
因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。
建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。
2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。
常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。
3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。
新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。
消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。
4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。
分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。
溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。
由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。
5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。
操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。
大鼠心肌细胞分离方法的改进石晓路;柳絮;郭会彩;张丽男;勾向博;熊晨;苏倩;王永利【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2010(26)5【摘要】目的介绍一种易于判断酶解终点的分离大鼠心肌细胞的方法.方法成年SD大鼠麻醉后开胸取出心脏,分别采用传统的Langendorff灌流装置和本实验室改进的Langendorff灌流装置,于恒温37℃灌流消化液(含0.6%胶原酶B,0.6% BSA,30 μmol·L-1 Ca2+的台氏液)分离细胞,并采用IonOptix单细胞动缘检测系统检测细胞功能.结果传统的Langendorff灌流装置分离细胞,酶解时间约13～16 min,但此法终点难以判断,每次分离的细胞质量差别较大,且不耐钙,收缩的稳定性较差.而以改进的Langendorff灌流装置分离细胞易于确定消化终点,细胞成活率大于80%,在含1.8 mmol·L-1 Ca2+的台氏液中存活率也高达50%.给予电压15 V、频率1 Hz、波宽4 ms的持续电刺激时,其在1 000 s内收缩舒张功能稳定.结论经改造的Langendorff灌流装置分离的心肌细胞成活率高,可控性强,结果稳定,能够更好地用于检测细胞收缩舒张功能的实验.【总页数】4页(P687-690)【作者】石晓路;柳絮;郭会彩;张丽男;勾向博;熊晨;苏倩;王永利【作者单位】河北医科大学,药理学教研室,河北,石家庄,050017;河北医科大学,药理学教研室,河北,石家庄,050017;河北医科大学,毒理学教研室,河北,石家庄,050017;河北医科大学,药理学教研室,河北,石家庄,050017;河北医科大学,药理学教研室,河北,石家庄,050017;河北医科大学,药理学教研室,河北,石家庄,050017;河北医科大学,药理学教研室,河北,石家庄,050017;河北医科大学,药理学教研室,河北,石家庄,050017【正文语种】中文【中图分类】R-332;R322.11;R329.24【相关文献】1.SD大鼠心肌细胞分离方法探索 [J], 张紫冠;李卫华;黄峥嵘;谢强;王鑫;王腾;黄从新2.新生SD大鼠心肌细胞分离培养及纯化的快速便捷方法及鉴定 [J], 付微;刘飞;乔陆明;张绪东3.新生大鼠心肌细胞分离、纯化及培养方法的改进 [J], 庞勇军;孙莉;谢文娟;莫书荣4.成年大鼠心肌细胞分离方法的改良 [J], 廖华;糜涛;涂志业;陈莉莉;郭小梅5.一种改良的原代大鼠乳鼠心肌细胞分离及培养方法 [J], 程俊;曾晓荣;谭晓秋;李鹏云;文静;陈琳琳;杨艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
成年大鼠心肌微血管内皮细胞的分离与培养陈小燕;樊梦雅;李慧;蒋易楠;靖静;张海龙【摘要】目的本文建立一种简便、高效的成年大鼠心肌微血管内皮细胞分离及培养的方法.方法选取7~8周龄Wistar大鼠,麻醉后开胸取出心脏,采用离体心脏灌流和酶消化法进行心肌微血管内皮细胞的分离;取第3代细胞观察其增殖特征并绘制增殖曲线;用免疫细胞化学和免疫荧光对细胞的第Ⅷ因子相关抗原和CD31进行鉴定,利用基质胶检验其血管形成能力.结果体外培养心肌微血管内皮细胞呈多边形或梭形,具有典型的铺路石样生长特点;同时,第Ⅷ因子相关抗原和CD31呈阳性;具备血管形成能力.结论本方法培养的成年大鼠心肌微血管内皮细胞具有较高的纯度,方法简便易行,可用于心血管疾病基础及临床研究.%Objective To establish a simple and efficient method for isolation and culture of adult rat cardiac micro-vascular endothelial cells. Methods Wistar rats were anesthetized and thoracotomy was performed. Cardiac micro-vascular endothelial cells were isolated by heart perfusion and enzyme digestion. The morphology and growth curve of the third generation cells were examined by inverted microsc opy. Its molecular markers factor Ⅷ-related antigen and CD31 were detected by immunocytochemistry and immunofluoresence. The angiogenic ability was examined by matrigel. Results The primary cultured cardiac microvascular endothelial cells in vitro were polygonal or fusiform with typical paving stone-like growth characteristics. At the same time,the cells were positive stained by factorⅧ-related antigen and CD31 and showed angiogenic ability. Conclusions Cardiac microvascular endothelial cells cul-tured by this method possess high purity. The method is easy tooperate and can be used for laboratory and clinical research of cardiovascular diseases.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2018(038)004【总页数】5页(P530-534)【关键词】细胞培养;内皮细胞;成年大鼠;心肌微血管【作者】陈小燕;樊梦雅;李慧;蒋易楠;靖静;张海龙【作者单位】河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;郑州大学基础医学院,河南郑州450001;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004【正文语种】中文【中图分类】R331心肌微血管是深入心脏内的终末细小分支，在心脏内分布广泛，结构上与其他血管不同，由单层内皮细胞和细胞外基质组成；微血管内皮细胞在表型与功能上均表现出不同于大血管内皮细胞的异质性，且其性质与功能在不同组织器官之间也具有显著差异[1]。
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原代心肌细胞培养曾石秀;廖伟【摘要】目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察.方法:取出生1～3d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度,结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92％,纯度90％,2～3d出现同步搏动.结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2012(032)002【总页数】3页(P167-169)【关键词】原代心肌细胞;培养;存活率;纯度【作者】曾石秀;廖伟【作者单位】南昌大学医学院,江西南昌330000;赣南医学院第一附属医院心内科,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院心内科,江西赣州 341000【正文语种】中文【中图分类】Q813.1+1原代细胞培养是分子生物学和细胞生物学研究的一项基本技术。
原代心肌细胞可保存其结构和功能上的某些特点，有自发性搏动，不受神经、体液因素的干扰，有利于直接进行生理、病理及药理等多方面的研究［1］。
本研究目的为探讨一种实用的原代心肌细胞培养方法。
1 材料与方法1.1 实验试剂与配制高糖DMEM、胰蛋白酶(Gibco 公司)，Ⅱ型胶原酶、BrdU(5-溴-2＇-脱氧尿苷)、0.4%台盼蓝(Sigma公司)、胎牛血清(Hyclone公司)，α横纹肌肌动蛋白(α-SA)单克隆抗体、免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物工程有限公司)。
1.2 实验动物出生1～3 d的SD大鼠的乳鼠，雌雄不限［清洁级，江西中医学院，许可证号 SCXK(赣)2010-0001］。
1.3 实验仪器超净工作台(上海博迅公司，型号SW-CJ-2FD)、CO2培养箱(Thermo公司，型号Forma311)、低速离心机(江苏环宇公司，型号80-2型)、高精度恒温水浴箱(上海博迅公司，型号SSW-600-2S)、倒置相差显微镜(Olympus公司，型号CKX 41)等。
新生大鼠原代心肌培养需高压消毒：工具盒：小转子；300目滤网×2；眼科剪（直剪×1，弯剪×2）；枪头盒（1mL、200μL、20μL）。
需提前配制并4⁰C预冷：D-Hank’s稀释的0.1%胰酶；加双抗的PBS。
1．麻醉与消毒：麻醉1-3天新生大鼠并用75%酒精浸泡消毒。
2．解剖：剪开胸腔，立即取出跳动的心脏并放入冰冷的PBS（加双抗）中，切取心室并转移到另一新鲜冰冷PBS中，初步洗去心室内的血液后将心室剪成1-3mm3的碎块，短暂离心几次，以去除红细胞。
注：所有操作在冰上进行。
注意防止污染。
红细胞会影响心肌细胞的贴壁。
3．预处理（20min）：将切碎的组织转移至0.1%胰酶溶液（0.5ml/1心脏）的40ml 培养瓶中（含转子，），置于冰上20min，每3min摇动一次。
注：这一步中使胰酶充分浸润组织块，以利于后续消化。
4．胰酶消化（15min）：将培养瓶置于37⁰C水浴15min，150-200rpm搅拌。
注：胰酶应为D-Hank’s配置，与PBS配置的相比，更利于心肌细胞的存活和贴壁。
5．吸取上清：将上步中的培养瓶斜放静置后，小心吸取上层的细胞悬液，移至50ml离心管（预先加入5-10ml含10%FBS的DMEM培养基）中，终止胰酶作用。
收集的细胞悬液置于4⁰C冰箱。
注：尽量吸取上清，不要吸到下层粘稠的DNA或者组织块。
6．重复消化：向培养瓶中补充胰酶，重复步骤4、5，直至组织块基本消化干净。
7．收集细胞：将所有上述收集的细胞悬液1000 rpm 5min收集细胞，将细胞种植于100mm培养皿中进行预贴壁培养。
8．细胞纯化（1.5-2h）：将步骤7中所得细胞培养1.5-2h以使非心肌细胞贴壁，然后将剩余细胞悬液以5×105个/ ml的密度种植于6孔板或100mm培养皿中，加BrdU至终浓度为0.1mmol/L，培养48小时以防止非心肌细胞增殖。
48小时后，更换不添加BrdU的DMEM培养基进行培养。
乳鼠原代心肌细胞的英语英文回答：Neonatal Rat Primary Cardiomyocytes Isolation and Culture.Neonatal rat primary cardiomyocytes (NRCMs) areisolated from the hearts of newborn rats and cultured in vitro as a model system for studying cardiac biology and function. These cells are highly differentiated and exhibit many of the characteristics of adult cardiomyocytes, including the ability to contract spontaneously and respond to pharmacological agents. NRCMs have been used extensively in research to investigate a variety of cardiovascular diseases, including heart failure, arrhythmias, and ischemic injury.Isolation of NRCMs.NRCMs are typically isolated from 1to 3-day-oldSprague-Dawley rats. The rats are euthanized and the hearts are removed and placed in sterile phosphate-buffered saline (PBS). The hearts are then minced into small pieces and digested with a collagenase solution. The resulting cell suspension is filtered and centrifuged to separate the cardiomyocytes from other cell types.Culture of NRCMs.The isolated NRCMs are resuspended in a culture medium supplemented with serum and antibiotics and plated onto culture dishes. The cells are allowed to adhere to the dishes for 24 hours, after which the medium is replaced with a serum-free medium. NRCMs can be cultured for up to 4 weeks, although they typically begin to lose their differentiated characteristics after 2-3 weeks.Characterization of NRCMs.NRCMs can be characterized by their morphology, electrophysiological properties, and contractile function. Morphologically, NRCMs are polygonal in shape and have acentral nucleus. They exhibit spontaneous contractions and respond to electrical stimulation. NRCMs express a varietyof cardiac-specific proteins, including sarcomeric proteins, ion channels, and calcium-handling proteins.Applications of NRCMs.NRCMs have been used in a wide range of research applications, including:Investigation of cardiac diseases: NRCMs have beenused to study the mechanisms underlying a variety of cardiovascular diseases, including heart failure, arrhythmias, and ischemic injury.Development of new drugs: NRCMs have been used to screen for new drugs that may be effective in treating cardiovascular diseases.Toxicology testing: NRCMs have been used to test the toxicity of new drugs and chemicals.Gene therapy: NRCMs have been used to study the effects of gene therapy on cardiac function.Advantages of NRCMs.NRCMs offer a number of advantages over other cell types for studying cardiac biology and function. These advantages include:High degree of differentiation: NRCMs are highly differentiated and exhibit many of the characteristics of adult cardiomyocytes.Spontaneous contractility: NRCMs exhibit spontaneous contractions, which makes it possible to study cardiac function without the use of electrical stimulation.Response to pharmacological agents: NRCMs respond to pharmacological agents in a manner similar to adult cardiomyocytes, which makes them a good model system for studying the effects of drugs on cardiac function.Easy to isolate and culture: NRCMs are relatively easy to isolate and culture, which makes them a cost-effective and convenient model system.Disadvantages of NRCMs.NRCMs also have some disadvantages, including:Limited lifespan: NRCMs can only be cultured for up to 4 weeks, which limits their use for long-term studies.Loss of differentiated characteristics: NRCMs begin to lose their differentiated characteristics after 2-3 weeks in culture, which limits their use for studying chronic cardiac diseases.Variability between preparations: The isolation and culture conditions can affect the properties of NRCMs, which can lead to variability between preparations.中文回答：新生大鼠原代心肌细胞——分离与培养。
新生大鼠原代心肌细胞分离实验用材料a) Fibronectin: Sigma; Catalog # 2891492b) Phosphate-Buffered Saline (PBS) Ca/Mg free: HyClone; Catalog #c). Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS, D-Hanks’),d) Trypsin: Gibco; Catalog # 27250-018（28mg）e) Collagenase Type I I: Gibco; Catalog # 17101-015（20mg）f) DMEM: Hyclone; Catalog # SH30022.08g) Fetal Bovine Serum (FBS): Gibco; Catalog # 16000-044原代新生乳鼠心肌细胞分离一、FN包被Cardio Plate（时间：约3小时）1．使用PBS缓冲液将1mg/ml的FN储存液按1：100的比例稀释成1ug/ml工作液2．在E-Plate Cardio 96每孔加入20—30 µl 配制好的1ug/ml的FN工作液。
3．将包被好的E-Plate Cardio 96 置于细胞培养箱内约3h左右。
二、原代大鼠心肌细胞分离（时间：约3小时）1. 获取大鼠心室组织(使用出生24h内的SD大鼠)。
1) 用70%的酒精消毒乳鼠。
2)无菌的解剖板上，左手用镊子固定乳鼠，右手持眼科剪，在无菌条件下迅速剪开胸骨剑突下稍左侧的皮肤。
换眼科剪，在胸骨剑突下稍左侧打开胸腔，左手轻轻用力，心脏跃出，用眼科弯镊取心脏心尖部，置于预冷的DMEM中，在预冷的DMEM 中漂洗3次，去除血液。
3) 将漂洗后的心尖组织在预冷的DMEM去除心房和血管等组织。
4) 在5ml玻璃瓶中加入2ml预冷的HBSS，将心尖转移到HBSS中，用眼科剪剪成约1mm3的小块。
新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法将大鼠的心肌细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物出生后1-4 天SD 乳鼠15 只。
2. 试剂低糖DMEM、胰酶(含EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。
0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精，培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。
3. 手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。
二、方法1. 将胰酶用D-Hank's 液配成0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。
2. 解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。
然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's 液中。
重复以上过程。
取材完毕后，撤掉取材的手术器械。
注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。
3. 用第二套手术器械进行下列操作。
用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。
分离大鼠原代心肌细胞
概述：
整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，大鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。
大鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。
材料：
1、培养液：1：1 混合的DMEM / F12 培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素。
2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05% ，用pH 7.2-7.8 的D-Hanks溶液配制，-20 ℃保存。
3、D-Hanks溶液（pH 7.2-7.8）：KCl 0.4 g 、KH2PO4 0.06 g 、NaCl 8.00g 、NaHCO3 0.35 g 、Na 2HPO4•7H2O 0.09 g 、酚红0.01 g 1L。
方法：
1、所有器械（四把镊子两把剪刀）放在75%酒精中浸泡6 h以上。
2、用D-Hanks溶液（过滤灭菌）配制0.1%胰酶15 mL备用（胰酶原液0.25%）。
3、新生（2-3天）vistar乳大鼠20只，器械在酒精灯上灼烧消毒备用。
4、准备两个冰盒，在其中一个冰盒中放两个平皿，皿内盛放D-Hanks 溶液（无色），把灼烧后的一把镊子倒插在该冰盒中（用于涮洗心脏）。
另一个冰盒中同样放两个平皿，其一放D-Hanks溶液，其二放1
mL0.1%胰酶，同样把灼烧后的一把镊子和一把剪刀（用于剪碎心脏）倒插在该冰盒中，所剩的两把镊子和一把剪刀灼烧后倒置用于解剖，切勿污染。
5、乳鼠两只一组处死消毒取样，方法：将其轮流放入装有75%酒精
的烧杯中6 s即可。
6、从胸骨下端开始向上解剖乳鼠，剪至颈部，打开胸腔，挤出心脏，用镊子取心脏心室部分放入第一个成有D-Hanks溶液的平皿中，速度越快越好，以保持心肌细胞的活性。
7、待取完所有心脏后，在冰盒中使用冰盒中的镊子涮洗和挤压心脏以尽量除去心脏中的血液，置于冰盒中的另一个平皿中，继续洗去血液，若有心脏上存有心房则用镊子拔去，可使用第二个冰盒中的镊子，依次放入第三个皿（第二个冰盒）中洗净。
8、将洗净的心脏放入第四个放有1 mL 0.1%胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶中，用剪刀剪碎心脏后，吸入所剩的14 mL胰酶中4 ℃消化过夜。
9、消化过夜后，吸出9 mL胰酶，加入9 mL0.1%的胶原酶Ⅱ（此时浓度为0.06%，配胶原酶需用0.2 μm滤器过滤），将15 mL的细胞液装入高压过的小烧杯中，加入磁力棒，在磁力搅拌器上搅拌30 min，温度维持在34 ℃左右，100—120 rpm。
10、配制两种培养液，DMEM-F1210%FBS，DMEM-F12 15%FBS Brdu （1 mg/mL的Brdu母液，在DMEM-F1215%FBS中每2mL加67 μL，心肌细胞对Brdu的耐受性较其他细胞高，以保护心肌细胞减少其他细胞主要是成纤维细胞的污染）。
11、消化30 min后可见细胞粘稠物附在磁力棒上说明消化较充分，将消化液吸入到10 mL DMEM-F12 10%FBS的培养基中，轻微吸打后，1000 rpm，10 min（血清可终止消化）。
12、弃上清，细胞沉淀中加入5 mL DMEM-F12 10%PBS再洗一次，1000 rpm，6 min。
13、弃上清。
用20 mL DMEM-F12 15%FBS Brdu洗细胞，用200目筛将细胞液过滤至两平皿中，10 mL/皿，培养箱培养2 h。
（此步因为成纤维细胞较心肌细胞早贴壁，用差速贴壁的方式消除成纤维细胞）
14、准备两个100 mm皿，在一个皿中吸入2 mL明胶，将明胶吸打使其覆盖整个皿底，所剩明胶吸入到另一个皿，重复操作3次，使两皿底铺满明胶，晾干。
明胶作用是便于心肌细胞更好的贴壁。
15、两小时后，显微镜下可见有部分细胞贴壁，将悬浮的细胞和液体吸入到一个50 mL的离心管中，用吸管轻轻吹打以打散细胞团，然后分装入已铺好明胶的两皿中，每皿10 mL。
16、24 h后，显微镜下可见跳动的心肌细胞，48 h换液。
