第13卷 第3期1998年6月荧光探针在蛋白质研究中的应用
Ξ王守业 余华明 张祖德 刘清亮
(中国科技大学化学系 合肥230026)
大学化学
摘要 荧光探针技术是研究蛋白质在水溶液中构象的一种有效方法。利用它可以测定蛋白
质分子的疏水微区内两基团的距离以及酶与底物结合过程中蛋白质构象的变化等。本文综述了荧光探针技术在蛋白质研究中的一些进展。
一、 引言
荧光探针技术是利用物质的光物理和光化学特性,在分子量级上研究在溶液中蛋白质构象的一种方法。该方法的最大特点是具有高度的灵敏性和极宽的动态响应范围。荧光探针物质之所以可被用来研究蛋白质的构象,主要是因为其具有特殊的光物理性质,如在不同极性介质中有着不同的光谱特性(即不同的峰值波长),不同的荧光量子产率和荧光寿命等。因此,测定荧光探针物质和蛋白质分子结合后荧光峰波长、位移及量子产率的变化,就可探知其所处微环境的极性及其他有关性质。利用荧光探针技术研究蛋白质在溶液中的构象有两种方法:一种是测定蛋白质分子的自身荧光,即“内源荧光”,另一种是利用荧光探测剂,即“外源荧光”。若引人的荧光探测剂为有机分子,则该分子叫做有机荧光探针;若引入的荧光探测剂为稀土离
子(如铽(Ⅲ)、铕(Ⅲ
)等),则该离子叫做稀土离子荧光探针。 二、 荧光探针的某些光物理和光化学特征
1. 有机荧光探针的某些特征
最常用的有机荧光探针物质有12苯胺基萘282磺酸(ANS ),22对甲胺萘262磺酸(2062TNS )和12N 0N 2二甲胺基萘252磺酸(1052DNS )(dansyl acid ),其结构如图1:θθSO -3
N θH θθSO -3N H θ
H 3C θθS O O
Cl
N H 3C CH 3
1,82ANS 2,62TNS 1,52DNS 2Cl
图1 1082ANS,2062TNS 和1052DNS 2Cl 的结构
这些化合物在水溶液中基本不发荧光,量子产率低(低于0.1),但在非极性溶剂中,其量子产率大增,荧光峰蓝移,且能和许多蛋白质结合。这种探针分子溶液的荧光光谱因溶剂极
Ξ本文为国家自然科学基金资助项目。
性改变而变化的现象称为溶剂致变色效应(solventochromism).利用这些化合物在不同蛋白质分子中量子产率、峰位及谱带的变化,就可探测蛋白质分子结合区的极性、疏水性的大小,从而推论构象的稳定情况及变化等。
2. 稀土离子荧光探针的某些特征[1,2]
铕(Ⅲ)和铽(Ⅲ)是最常用的两种稀土荧光探针。图2是铕(Ⅲ)和铽(Ⅲ)的荧光光谱[3]。铕(Ⅲ)和铽(Ⅲ)的最大荧光峰分别出现在612nm和545nm处,分别对应于5D0→7F2和5D4→7F5跃迁。
图2 0.01mol/L Eu(Ⅲ)(a)和Tb(Ⅲ)(b)的荧光光谱
铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)f电子的激发方式有两种,即直接激发和间接激发。488nm的激光光源可使铽(Ⅲ)发生7F6→5D4跃迁,这种激发方式为直接激发。若通过激发邻近发色团,发色团将能量转移到铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)而使其激发的方式为间接激发。铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)荧光光谱的高灵敏性和不同环境对荧光的影响等,使得铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)成为研究蛋白质的有效探针。
三、 利用荧光探针研究蛋白质活性部位微环境
作为一个好的荧光探针应满足以下条件[4]:①探针分子与蛋白质分子的某一微区必须有特异性的结合,并且结合比较牢固;②探针的荧光必须对环境条件敏感;③蛋白质分子与探针结合后不应影响其原来的结构和特性。在满足这些条件的基础上可进行:
1. 在不均匀体系中结构类型分布的研究
ANS、TNS、DNS这一类极性荧光探针的荧光特性对周围介质的极性十分敏感。根据这一特点,早期的研究曾用ANS作荧光探针研究了肌红蛋白和血红蛋白的血红素结合微区。Prasad用Bis2ANS作荧光探针研究微管蛋白(Tubulin)[5],确定了Bis2ANS在微管蛋白上有两个结合部位,测得两个结合部位的解离平衡常数分别为217μm和2212μm。Prasad的研究表明:当Bis2ANS等有机探针与蛋白质结合后,蛋白质上的Trp残基可将吸收的能量无辐射地转移到Bis2ANS等上。
除了ANS、TNS、DNS等对环境敏感的萘衍生物类探针外,Weber还合成出了另一类对
环境敏感的萘衍生物探针[6]:62丙酰基222(N0N2二甲胺基)萘(FRODAN),22(N0N2二甲胺基)262萘酰242反2环己酸(DANCA)等。其结构如图3:
θθN
CH3
CH3
C O
R
FRODAN:R=—CH2CH3
DANCA:R=COOH 图3 FR ODAN和DANCA的结构
这些有机荧光探针就其结构而言,都有较大而明确的激发态偶极距。Lasagna等用FRODAN和DANCA作荧光探针研究了辣根过氧化物酶的血红素结合部位。
Tolasa和Leah[7]最近设计并合成了一系列通式为Ar(2CH2)n2Q的荧光探针,这些具有双发色团的分子可与蛋白质形成氢键,产生疏水作用和静电作用,可用以研究这些探针的蛋白质结合性质,已用这些探针研究了血清蛋白和钙调蛋白。当芘基探针PBAC(n=4,Q=N H+4)和钙调蛋白结合时,两芘基发色团分别结合在钙调蛋白的两相邻微区,引起钙调蛋白构象发生转变,此时PBAC形成一激态分子。
按照F ster偶极2偶极无辐射能量转移机理,结合在不同蛋白质上的铽(Ⅲ)与结合在同一蛋白质不同结合部位铽(Ⅲ)会有不同程度的铽荧光敏化。正是这一特点可使我们利用稀土荧光探针研究蛋白质分子中金属离子结合部位的差异。如含Trp残基的蛋白质内的钙(Ⅱ)结合的分类研究[8,9]。
铕(Ⅲ)的7F0→5D0跃迁为单线态到单线态的跃迁,若体系中所有的铕(Ⅲ)处于相同的环境,则对应于7F0→5D0跃迁激发峰为单峰,即监测激光诱导的7F0→5D0诱导激发峰形,可确定金属离子结合部位微环境是否相同。如Mulqueen等利用Eu(Ⅲ)的7F0→5D0激发峰研究了钙调蛋白[10],结果表明Eu(Ⅲ)和钙调蛋白有两个强结合部位和两个弱结合部位。
2. 特定结合部位微环境研究
当一个分子的发射光谱和另一分子的吸收光谱相重叠时,通过分子间偶极2偶极的共振偶合可使能量从给体转移到受体。按照F ster理论,能量给体和能量受体间距离r与能量转移效率为50%时所对应的临界能量转移距离R0及能量转移效率E之间有如下关系:
r=R0(E-1-1)1/6(1)其中:R06=8178×10-25K2φn-4J(2) K2是和能量给体及受体跃迁矩相互取向有关的因子;n是溶剂的折射率;φ为当无受体存在时能量给体的荧光量子产率;J为光谱的重叠积分,且有:
J=∫F(ν)ε(ν)ν-4dν
∫F(ν)dν(3)
F(ν)为能量给体的荧光强度;ε(ν)为能量接受体的摩尔消光系数,单位是(mol/L)-1 cm-1;ν是波数,单位是cm-1。
由临界转移距离R0(在计算R0时可认为能量给体与受体间相互取向是无规则的,此时因子K2=2/3)和实验测得的能量转移效率E就可测出能量给体与受体间的距离r。在早期生化研究中曾对胰朊酶分子中的Trp与标记的丹酰(Dansyl)基两者之间的能量转移效率降低
