一、石蜡油低温保藏法
本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌
体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水
分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在
-4～4℃下。液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。具体操作是：菌种
为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶
中经过121℃高压蒸汽灭菌1～2h，将其放烘箱中(160℃左右)干热处
理，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入
斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm为
宜。
二、甘油管冷冻保藏法
1．试验方法介绍本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受到
抑制的原理达到保藏目的。其方法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待
用。将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液(108～
1010/ml)。取1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为
10%-30%，于-70℃下冻存。-20℃保存时间较短。或采用体积比为8：
2的甘油－生理盐水，加入新鲜培养的菌体肉汤，混合均匀后至-20
℃冰箱保存。
2．效果该法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、
弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果
好，无变异现象发生。甘油－生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液，
其原因可能是加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用，且有肉汤培
养物适量增加保存液的营养成分，从而更好地保护了待保存的菌株。
三、真空冷冻干燥法
1．试验原理
真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏
的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、
酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物
不到2%。冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件
下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华
过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细胞悬液，使菌在冻结和
脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产
菌种保存方法
a. 常用有以下方法：
1 半固体保存法 ：将菌落穿刺接种在半固体中，4度存放，一般可以管3－6月
2 低温冻存法：接种菌落的肉汤加20％灭菌甘油，置－20或－70度，可存放一年以上。
3 真空冻干法：试最理想的保存方法，但需要特殊仪器
b. 基因工程菌：
1：30%的灭菌甘油与培养好的菌悬液按照1：1的比例混合，分装到1.5ML的离心管中，每关1ML，存于--20度，但仅保存半年就不太好了，最好保存到——70度的低温冰箱中。
也可用10%的灭菌甘油从斜面上洗下保存。
2：菌悬液中加甘露醇和人血白蛋白
c. 目前菌种的保存方法主要有以下几种:1.传代培养保存法:一般来说,这是最基本的保存法,用斜面,穿刺或其他方法培养的传代菌种,一般要保存在5度,但因类而异,如霍乱,淋球,脑膜炎,厌氧菌,钩体等要保存于37度为宜.2.液体石蜡覆盖保存法:这是传代培养的变相方法,可以适当地延长保存时间,主要适用于霉菌,酵母菌,放线菌,需氧性细菌等的保存.3.载体保存法1)土壤保存法:主要用于形成孢子回孢囊的微生物的保存,特别适用于真菌和放线菌不改变性状的长期保存.(2)砂土保存法:常用于梭状芽孢杆菌和一部分霉菌的保存,可保存数年.(3)硅胶保存法:本法对保存链孢霉菌较有效,对酵母菌的保存也较有效(4)磁珠保存法:用本法保存根瘤菌在室温下至少可保存2年半(5)滤纸保存法:适用于对干燥抵抗力较强的微生物,如油芽孢细菌和葡萄球菌.另外噬菌体,放线菌和丝状菌也可用本法.4.悬液保存法1)蒸溜水保存法:霉菌,酵母菌和放线菌的大部分,使其悬浮于蒸馏水中,可在室温下保存数年,青枯病假单孢杆菌也可用本法.(2)糖液保存法:过去用于保存酵母菌,但现在已不常用.(3)其他悬液保存法:如乳链球菌可用PBS保存,放线菌可用0.125%稀琼脂液保存.5.寄主保存法:一些微生物如一部分病毒,立克次氏体,螺旋体.原虫和少量丝状菌目前只能使活着的动物,昆虫,植物体和寄生微生物等感染并传代,否则不能保存.6.冷冻保存法1)低温冰箱保存法:多说微生物在-20度保存效果良好,(2)干冰保存法:-70度保存,(3)液氮保存法:保存温度克达到-196度,本法可说是使用范围最广的微生物保存法.7.冷冻干燥保存法:使微生物在冷冻状态下,在减压下利用升华现象除去水份,使细胞的生理活动事实上停止,从而长期维持生活状态,本法适用于大多数细菌和放线菌,另外病毒,噬菌体,立克次氏体,霉菌和酵母菌再多数情况下用本法保存.8.冷冻干燥以外的干燥保存法1)常压干燥保存法,(2)菌片封袋干燥保存法,(3)Stamp干燥保存法,(4)Sordelli干燥保存法,(5):L-干燥保存法(真空干燥保存法)
- 1 - 实验室菌种的保藏方法
一、甘油悬液保藏法
此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用-20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可达10年。
将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在10％～15％，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。
二、冷冻真空干燥保藏法
冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。但该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。
保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌 - 2 - 的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
三、液氮超低温保藏法
液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。美国ATCC菌种保藏中心采用该法时，把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制致冷速度，以每分钟下降1℃/min的速度从0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。如果降温速度过快，由于细胞内自由水来不及渗出胞外，形成冰晶就会损伤细胞。据研究认为降温的速度控制在（1～10）℃/min，细胞死亡率低；随着速度加快，死亡率则相应提高。
沙土管法
将沙或土过筛﹑烘干﹑装管﹑灭菌﹑然後将菌种制成孢子悬液滴入其中混匀﹐放到盛氯化钙的干燥器里吸除水分﹐干燥後保存或用火焰封管後保存。吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而处于休眠状态﹐可保存较长时期。此法适用于芽孢杆菌﹑梭状芽孢杆菌﹑放线菌﹑镰刀菌等。
甘油管好弄，你首先用水把孢子收集起来弄成孢子悬液，然后用孢子滤器过滤一下之后，离心收集孢子，用20%的甘油（甘油的浓度好像不同实验室方法还不太一样，有的用的是30%）重悬，然后就可以放-80度保存了~
小白1126 (站内联系TA)
我这边用了一个超级简单的甘油保存法，希望对你有所帮助，先把纯甘油灭菌，待冷却后直接加入生长好的好的斜面里，甘油的量以刚淹没斜面最好，然后将斜面直立放置于4摄氏度冰箱里，用该方法保藏菌种可存活半年左右
aloon111 (站内联系TA)
安瓿管要有冷冻干燥，还要真空，不好操作
ghycxy (站内联系TA)
甘油保存法：把菌孢子用少量无菌水收集到小试管中，加入灭菌甘油，使管中甘油浓度大于70%，摇匀，存入冰箱，
一般我在保存放线菌时，也是保存放线菌孢子的。先是制备孢子悬液，离心收集孢子，20%甘油悬浮，分装保种管，-80℃冰箱保存。不过没有长时间（>1y)来验证好坏，但我觉得放线菌活力还好，也没有什么污染，关键是很方便操作。
放线菌的菌落放线菌的菌落放线菌的菌落放线菌的菌落 放线菌在固体培养基上形成与细菌不同的菌落特征，放线菌菌丝相互交错缠绕形成质地致密的小菌落，干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽
细菌保存：液体培养，至OD>0.1，再与50%的甘油等体积混合，甘油要两次灭菌
菌种保存原理：菌种冻存与复苏原则是：慢冻速融。即冻存时要先-20℃，在冻存-80℃。而复苏时直接将冻存的丢37℃快速融化。
