Klenow Fragment

识别位点
剪切位点
MS
R
75kD
108kD
Ⅲ 型酶有两个亚基：MS 亚基在靶位点负责识别 和甲基化； R 亚基在其邻接位点起限制作用
基因工程中最常用的是Ⅱ型酶 三. Ⅱ型酶的命名,书写与剪切方式：
限制酶 来源 剪切方式 Eco R I Escherichia coli RY 13 G↓AATTC Pst I Providencia stuartii 164 CTGCA↓G BseⅡ Bacilus stearothermophilus strain 822 (HpaⅠ) GTT↓AAC
二.甲基化酶(methylase)
可使DNA甲基化。有两种： dam 甲基化酶和dcm甲基化酶 N6A甲基化 5`－GmATC－3` C5C甲基化 CmCAGG 或 CmCTGG 用途中的EcoRI酶切位点，然后将修饰 的片断与人工EcoRI接头连接，接头用EcoRI 切割后，将DNA片断插入噬菌体DNA中。
B 5’ P B OH P P P ATP PPi P P P OH P P NAD B B T4 ligase NMN B B B B B E.coli ligase 3’ P P P B B B
连接酶的功能： (1)能封闭DNA双链或RNA/DNA杂种双链中的单 链缺口，而不能封闭双链RNA中的单链缺口 (2)能封闭粘性末端退火后出现的缺口； 用途： (1)通过粘端连接DNA分子； (2)连接平端双链DNA分子或平端DNA与人工接 头的连接。
1962 , Arber, 1968 Smith 发现限制性酶
W. Arber (t Basel, Switzerland
H. O. Smith (1931 －) Johns Hopkins University School of Medicine,USA

DNA Polymerase-palm domain
1. Contains two catalytic sites, one for addition of dNTPs and one for removal of the mispaired dNTP. 2. The polymerization site: (1) binds to two metal ions that alter the chemical environment around the catalytic site and lead to the catalysis. (2) Monitors the accuracy of base-pairing for the most recently added nucleotides by forming extensive hydrogen bond contacts with minor groove of the newly synthesized DNA. 3. Exonuclease site/proof reading site
原核生物中的三种DNA聚合酶
pol Ⅰ 5'→3'聚合酶活性 5'→3'外切酶活性 3'→5'外切酶活性 生理功能 + + +
去除引物,填补缺口 修复损伤 校正错误
pol Ⅱ + +
未知
pol Ⅲ + +
DNA 复制 校正错误
• 在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶 有五种，分别命名为DNA聚合酶α（pol α），DNA聚合酶β（polβ），DNA聚合 酶γ（polγ），DNA聚合酶δ（pol δ）， DNA聚合酶ε（polε）。 • 参与染色体DNA复制的是polα（延长滞 后链）和polδ（延长前导链），参与线 粒体DNA复制的是polγ，polε与DNA损 伤修复、校读和填补缺口有关，polβ只 在其他聚合酶无活性时才发挥作用。

基因工程复习题一、名词解释：（10～20%）基因工程基因工程工具酶限制性内切酶限制性内切酶得Star活性PCR引物PCR扩增平台期DNA芯片基因组文库cDNA文库转化限制与修饰系统原位杂交：将细胞或组织得核酸固定保持在原来得位置上，然后用探针与之杂交得一种核酸分子杂交技术，该方法可较好地反映目得基因在细胞或组织中得分布与表达变化。

粘性末端：双链DNA被限制性内切酶切割后，形成得两条链错开几个碱基，而不就是平齐得末端。

Northern印迹杂交：将RNA进行变性电泳后，再转移到固相支持物上与探针杂交得一种核酸分子杂交技术，可用于检测目得基因得转录水平。

转位：一个或一组基因片段从基因组得一个位置转移到另一个位置得现象。

基因工程：在体外，用酶学方法将各种来源得DNA与载体DNA连接成为重组DNA，继而通过转化与筛选得到含有目得基因得宿主细胞，最后进行扩增得到大量相同重组DNA分子得过程称为基因工程，又称基因克隆、DNA克隆与重组DNA等。

目得基因：基因工程中，那些被感兴趣得、被选作研究对象得基因就叫作目得基因。

连接器：人工合成得一段含有某些酶切位点寡核苷酸片段，连接到目得基因得两端，便于基因重组中得切割与连接。

转化：受体细胞被导入外源DNA并使其生物性状发生改变得过程。

停滞效应：PCR中后期，随着目得DNA扩展产物逐渐积累，酶得催化反应趋于饱与，DNA 扩增产物得增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。

逆转录PCR：以mRNA为原始模板进行得PCR反应。

PCR: 即聚合酶链式反应。

在模板，引物，4种dNTP与耐热DNA聚合酶存在得条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间得DNA区段地酶促合成反应。

α-互补（α-complementation）：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中，插入了lac启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸得核苷酸序列（又称α-肽），该序列不能产生有活性得β-半乳糖苷酶。

名词解释分子诊断学（molecular diagnostics）：分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、诊断、治疗和转归提供信息和依据的一门学科。

基因组(Genome)：指生物体全套的遗传信息。

基因组学是研究生物基因组的组成、组内各基因的结构、功能及表达调控的科学，包括基因组核苷酸序列测定、基因组作图、基因定位及基因功能分析等。

基因组学（genomics）：是研究生物基因组的组成，组内各基因的结构、功能及表达调控的科学，包括基因组核苷酸序列测定、基因组作图、基因定位及基因功能分析等。

包括结构基因组学和功能基因组学。

人类基因组多样性（human genome diversity）同一种或不同种基因组均存在或多或少的差异，这种差异称人类基因组多样性。

微卫星DNA多态性：微卫星DNA的排列方式有的三种：完全重复（无间隔），不完全重复（有非重复序列的间隔）和混合重复（2个或多个重复序列彼此毗连连续出现）。

完全出现最多见的方式。

转座因子：能在基因组中从一个位点移至另一位点的DNA序列，称为转座因子或转座元件。

黏性末端：对于双链DNA病毒而言，基因组双链两端具有能够互补的单链DNA部分，称为黏性末端。

重叠基因（overlapping gene）：是指两个或两个以上基因的ORF共有一段DNA序列，即某段DNA序列成两个或两个以上基因的共有的组成部位。

分段基因（segnented genome）：是指病毒基因组中由几条不同的核酸分子组成，另见于tRNA病毒、RNA病毒及双链RNA病毒。

人类基因组计划（HGP）：是旨在测出人类基因组30亿碱基对的核苷酸序列，发现所有人类基因并确定他们在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息，发展基因组学新技术，探讨人类基因组研究的社会、法律和伦理等问题的一个国际性研究项目。