D-半乳糖致大鼠衰老模型的研究

浙江临床医学２０１２年２月第１４卷第２魍　・基础ＸＯＩ＂究・　Ｄ一半乳糖致大鼠衰老模型的研究　王　暖黄红莉　周　昊杨秀华耿德勤　・１２９・　

【摘要】　目的探讨Ｄ一半乳糖腹腔注射法致大鼠衰老的合适剂量，以复制可靠的大鼠衰老模型。方法３２只ｓＤ大鼠　随机均分为Ｄ一半乳糖低（１５ｍｇ／ｋｇ）、中（３０ｍｇ／ｋｇ）、高（６０ｍｇ／ｋｇ）剂量组和假手术组四组，Ｙ型迷宫测定各组大鼠认知能　力；焦油紫染色，ＴＵＮＥＬ法检测其海马区细胞形态学变化、神经元凋亡；免疫组织化学染色检测Ｐ—ＡＫｔ表达水平。结果　和假手术组相比较，其他三组大鼠错误次数增加、时间延长，海马区锥体细胞层损伤严重，可见较多ＴＵＮＥＬ阳性神经元，Ｐ—　ＡＫｔ活性明显降低，尤以Ｄ一半乳糖高剂量组最明显。结论Ｄ一半乳糖高剂量组大鼠认知障碍、海马区细胞凋亡及Ｐ—　ＡＫｔ表达障碍最明显，可以复制出与衰老大鼠程度近似的模型。　【关键词】　Ｄ一半乳糖凋亡Ｐ—ＡＫｔ衰老模型　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｄｏｓａｇｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｇｉｎｇ　ｍｏｄｅｌ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｄ—ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ａｇｉｎｇ　ｍｏｄｅ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｉｒｔｙ—ｔｗｏ　Ｓｐｒａｑｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｆｏｕｒ　ｇｒｏｕｐｓ：１５ｍｇ／　ｋｇＤ—ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ、３０ｍｇ／ｋｇＤ—ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ、６０ｍｇ／ｋｇＤ—ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｓｈａｍ　ｇｒｏｕｐ．Ｙ—ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｍａｚｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｒａｔｓ；ｕｓｉｎｇ　ｃｒｅｓｙｌ　ｖｉｏｌｅｔ　ｓｔａｉｎｉｎｇ、ＴＵＮＥＬ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ；ｕｓｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　Ｐ—Ａｋｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｈａｍ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｏｆ　Ｄ—ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ　ｓｈｏｗｅｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｅｒｒｏｒ　ｔｉｍｅｓ　ａｎｄ　ａｖｅｒａｇｅ　ｔｉｍｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｙ—ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｍａｚｅ；ｎｅｕｒｏｎｓ　ｉｎ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ｓｕｂｆｉｅｌｄ　ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ　ｄｅｓｔｒｏｙｅｄ—ｆｏｒｍｅｒ　ｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　ＴＵＮＥＬ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ；ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　Ｐ—ＡＫｔ　ｄｅｐｒｅｓｓｅｄ；ｔｈｅｓｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ａｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｉｎ　６０ｍｇ／ｋｇＤ—ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｏｆ　６０ｍｇ／ｋｇＤ—ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ　ｓｈｏｗｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｌｅ　Ｐ—Ａｋｔ　ｌｅｖｅｌ　ａｎｄ　ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｗｈｉｃｈ　ｃａｎ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ａｇｉｎｇ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｌｄ　ｒａｔｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｄ—ｇａｌａｃｔｏｓｅ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｐ—ＡＫｔ　Ａｇｉｎｇ　ｍｏｄｅｌ　Ｄ一半乳糖（Ｄ—ｇａ１）致衰老模型有与人类自　然衰老相类似的生化改变、细胞退行性变及记忆　巩固和再现障碍等，已得到多方面实验证实。Ｄ一　半乳糖的神经毒性可能和脑细胞凋亡有关¨　，近　年来发现磷酸化的ＡＫｔ（Ｐ—ＡＫｔ）在细胞凋亡和存　活中发挥重要的生物作用　ｊ。腹腔注射Ｄ一半乳　糖是常用的复制衰老模型的方法，已广泛用于衰　老机制、老年病、抗衰老药物筛选等方面的研究。　本研究运用行为学、组织病理学、ＴＵＮＥＬ法、免疫　组织化学染色等检测方法，观察Ｄ一半乳糖对大鼠　认知能力、海马细胞凋亡及Ｐ—ＡＫｔ表达的影响，　探讨Ｄ一半乳糖腹腔注射致大鼠衰老的合适剂量，　为复制模型提供方法和标准。　基金项目：江苏省脑病生物信息重点实验室开放课题资助项目　（编号Ｊｓｂｌ０７０１）　作者单位：２２１０００江苏省徐州市第一人民医院神经内科　（王暖黄红莉周昊杨秀华）　２２１０００徐州医学院附属医院神经科（耿德勤）　１材料与方法　１．１材料健康Ｓｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）大鼠，雌　雄各半，体重２８０～３５０ｇ，由徐州医学院实验动物　中心提供。Ｐ—ＡＫｔ（ｓｅｒ４７３）抗体及二抗均购自美　国Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司，Ｙ型迷宫、ＴＵＮＥＬ试剂盒及免　疫组化试剂盒购自国内。　１．２方法　１．２．１实验分组和方法Ｙ型迷宫筛选自发活动　活跃，对电击敏感的健康ＳＤ大鼠３２只，随机分为　四组：假手术组、Ｄ一半乳糖低剂量组（Ｇａｌ—Ｌ）、Ｄ　一半乳糖中剂量组（Ｇａｌ—Ｍ）和Ｄ一半乳糖高剂量　组（Ｇａｌ—Ｈ），假手术组腹腔注射等量生理盐水，另　三组分别腹腔注射Ｄ一半乳糖１５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、　６０ｍｇ／ｋｇ），１次／ｄ，连续８周。　１．２．２认知功能测试大鼠造模前及造模２、４、６、　８周分别进行Ｙ型迷宫实验。记录连续２０次电击　中的错误次数及时间，以此作为认知功能的指标。

　・ｌ３０・　１．２．３焦油紫染色、ＴＵＮＥＬ及免疫组化染色８周　后将大鼠麻醉，仰卧于固定台上，暴露心脏，经左心　室插入导管至升主动脉，剪开右心耳，先快速灌注生　理盐水１０～１５ｒｎｌ，再灌注４℃的４％多聚甲醛至老鼠　四肢僵直为止，然后断头取脑，在视交叉后１ｍｍ及　４ｍｍ处以冠状切面切开鼠脑留取中间切块，置入　４％多聚甲醛中后固定２４～４８ｈ。然后按以下程序　操作：固定组织块，经流水冲洗１—１．５ｈ，８０％、９５％、　１００％梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，每一　组织块作５　ｍ的连续切片，贴附于载玻片，６０￣Ｃ～　７ＯｃｌＣ烤片６ｈ以上，用焦油紫染色、ＴＵＮＥＬ法染色和　免疫组化染色。在４００倍显微镜下左侧海马区随机　取５个不重叠的视野进行ＴＵＮＥＬ、Ｐ—ＡＫｔ阳性神经　元计数（个／视野），取其平均值。　１．３统计学处理数据以（ｘ±ｓ）表示，采用ＳＰＳＳ　１１．０软件进行统计分析。以Ｐ＜０．０５为差异有统　计学意义。　２　结果　２．１　Ｙ迷宫检测结果比较　（１）大鼠连续２０次　电击错误次数比较：与假手术组相比，Ｇａｌ—Ｈ组错　误次数明显增加（６周后Ｐ＜０．０５，８周后Ｐ＜　０．Ｏ１）；４周后Ｇａｌ—Ｍ组和Ｇａｌ—Ｈ组错误次数均　明显增加，与造模前相比差异有统计学意义（Ｐ＜　０．０５），６周后Ｇａｌ—Ｈ组差异更明显（Ｐ＜０．Ｏ１）。　见表１。（２）大鼠连续２０次电击平均时间比较：　Ｇａｌ—Ｈ组时间呈逐渐上升趋势，尤为４周后明显；　假手术组、Ｇａｌ—Ｌ组和Ｇａｌ—Ｍ组变化曲线基本平　稳。见图１。　表１各组大鼠错误次数比较（次。ｘ　４－ｓ】　造模前　造模２周　造模４周　造模６周　造模８周　假手术组１　８±０．８　ｃａｌ—Ｌ组２．０±０　９　Ｇａｌ—Ｍ组１　７±０　８　Ｇａｌ—Ｈ组１　８±０．８　２　３±０．８　２．７±Ｏ．５　３．２±０　４＃　３，８±０．４　辅　假手术组　一Ｍ组　Ｇａｌ—Ｈ组　图１各组大鼠连续２０次电击的平均时间比较　浙江临床医学２０１２年２月第ｌ４卷第２期　２．２海马区焦油紫染色结果比较假手术组海马　区神经元排列规则、紧密，细胞界限清楚，细胞带　完整；Ｇａｌ—Ｈ组海马区细胞带不完整，其中部分细　胞损伤严重，排列紊乱，神经元脱失，细胞界限不　清楚；Ｇａｌ—Ｌ组和Ｃａｌ—Ｍ组神经元破坏不明显。　几尢图２。　■■■■　图２海马区神经元排列（×４００）。Ａ为假手术组，Ｂ为Ｇａｌ—Ｌ组，ｃ为Ｇａｌ　—Ｍ组．Ｄ为Ｇａｌ—Ｈ组　２．３海马区ＴＵＮＥＬ阳性神经元数比较假手术　组海马区未见ＴＵＮＥＬ阳性神经元；半乳糖组可见　较多的ＴＵＮＥＬ阳性神经元，细胞核固缩深染，呈现　棕黄色；Ｇａｌ—Ｌ组ＴＵＮＥＬ阳性神经元（１．９±０．９）　个／视野，与假手术组相比，差异有统计学意义（Ｐ　＜０．０５）；Ｇａｌ—Ｍ组和Ｇａｌ—Ｈ组ＴＵＮＥＬ阳性神　经元分别为（７．９±０．８）个／视野和（３６．３±１．１）　个／视野，与假手术组相比，差异均有统计学意义　（Ｐ＜０．０１）。　２．４海马区Ｐ—ＡＫｔ阳性神经元数比较假手术　组海马区可见较多Ｐ—ＡＫｔ阳性表达细胞，每一视　野（２４．０±２．９）个，染色深，胞浆着色呈棕黄色；半　乳糖组海马区阳性表达细胞明显减少，Ｇａｌ—Ｍ组　和Ｇａｌ—Ｈ组分别为（１４．３±１．２）个／视野和（８．７　±１．１）个／视野，与假手术组相比，差异有统计学　意义（Ｐ＜０．０５和Ｐ＜０．０１）；Ｇａｌ—Ｌ组（２１．５±　２．０）个／视野，与假手术组相比，差异无统计学意　义（Ｐ＞０．０５）。见图３。　■■■■　图３海马区Ｐ—ＡＫｔ阳性表达（ｘ４００）。Ａ为假手术组，Ｂ为Ｇａｌ—Ｌ组，Ｃ　为Ｇｅｌ—Ｍ组．Ｄ为Ｇａｌ—Ｈ组　３讨论　研究衰老机制、老年病，需要可靠的衰老模　型，复制衰老模型的依据是目前公认的几种衰老　学说。Ｄ一半乳糖致衰老模型是我国学者基于衰　

老的代谢学说而复制的衰老模型，该模型具有复　浙江临床医学２０１２年２月第１４卷第２期　制方法简便、耗时短等优点，且不存在性别差　异＿３］，这可能与糖代谢紊乱、Ｄ一半乳糖醇中毒和　活性氧自由基过剩等有关　Ｊ。近年来的许多研究　发现，ＰＩ３Ｋ活化的ＡＫｔ能够作用于下游关键的凋　亡蛋白，如凋亡Ｂｅｌ一２家族成员的促凋亡因子Ｂｃｌ　一２拮抗剂（Ｂｅｌ一２／Ｂｃｌ—ｘｌ—ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ　ｃａｕｓｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ，Ｂａｄ）、Ｆｏｒｋｈｅａｄ转录因子家族成员　（Ｆｏｒｋｈｅａｄ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ）、糖原合成　酶激酶一３ｐ（ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ一３ｐ，Ｇｓｋ　一３Ｂ）　、ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ一９　，以及该因子一ＫＢ（Ｎｕ．　ｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ—ＫＢ，ＮＦ—ＫＢ）　、ｐ５３结合蛋白　（Ｍｏｕｓｅ　ｄｏｕｂｌｅ　ｍｉｎｕｔｅ　２，ｈｕｍａｎ　ｈｏｍｏｌｏｇ　ｏｆ　ｐ５３一　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｍｄｍ一２）　，使其磷酸化进而产生　介导细胞抗凋亡的生物学功能。　许多研究表明，衰老大鼠不但出现基底前脑　胆碱能神经元的丢失、海马的胆碱能纤维减少和　胆碱乙酰转移酶（ＣｈＡＴ）活性下降，而且出现学习　记忆障碍和神经细胞的凋亡，海马这一与学习记　忆关系非常密切的脑区，已证实其突触结构参数　在衰老过程中发生的显著改变。Ｄ—ｇａｌ可引起大　鼠出现脑老化，表现认知功能下降，脑组织中血清　超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性下降，丙二醛（ＭＤＡ）、　脂褐素水平升高，谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ—　Ｐｘ）水平降低，并出现明显的神经细胞凋亡。有学　者研究证明Ｄ一半乳糖造模组海马有８种蛋白的　相对百分含量变化大于５％，４种升高，４种降低。　本实验结果表明，８周后Ｄ—ｇａｌ　６０ｍｇ／ｋｇ组大鼠错　误次数明显增加，连续２０次电击的平均时间明显　延长，表现出认知功能下降的衰老现象，海马区细　胞损伤严重，而Ｄ—ｇａｌ　１５ｍｇ／ｋｇ组和３０ｍｇ／ｋｇ组　上述改变不明显。半乳糖各剂量组ＴＵＮＥＬ阳性神　经元均明显增多，尤以Ｇａｌ—Ｈ组，提示Ｄ—ｇａｌ是　一种有效的凋亡诱导剂，这可能是其促进神经元　退行性变的重要机制。关于Ｄ—ｇａｌ诱导细胞凋亡　的机制可能与其导致的氧化应激反应加剧有关。　Ｃｏｌａｎｇｅｌｏ等对ＡＤ患者进行海马的１２６３３个基因　的芯片扫描，发现氧化应激在神经元消失中起着　决定性作用，同时这种反应很可能导致神经原纤　维缠结（ＮＦＴ）、Ｂ一淀粉样蛋白（　—ａｍｙｌｏｉｄ　ｐｍ—　ｔｅｉｎ，Ａ１３）沉积、神经毒性肽以及早衰蛋白（ＰＳ１）的　产生　。　有学者利用神经细胞抗体分泌技术成功制备　・１３１・　出抗ＮＧＦ重组抗体的转基因小鼠，这种转基因小　鼠很快出现（２月龄）ｔａｕ蛋白过度磷酸化和ＣｈＡＴ　活性降低，以及行为学的障碍，到１１月龄，脑内出　现大量Ａ１３沉积、ＮＦＴ以及神经细胞丢失。由于这　种小鼠出现与人ＡＤ十分类似的神经病理改变，所　以有理由推测人的ＡＤ发病机制与发育成熟后，脑　内ＮＧＦ随增龄而表达减少或不能发挥正常功能　（如信息转导障碍）有密切关系。在中枢神经系统　中，神经生长因子（ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）与其　相应受体结合，启动ＰＩ３Ｋ—ＡＫｔ信号转导途径使　神经元存活并维持正常功能　。ＰＩ３Ｋ／ＡＫｔ通路　是一公认的细胞存活通路，介导多种生长因子的　生物学效应，如促细胞存活、诱导细胞分化和促细　胞生长等　“Ｊ，是抗凋亡、促进细胞增殖的重要信　号途径　ｚ一”Ｊ。当各种原因引起神经存活因子减少　或损伤性因素增加时，对信号传导通路的刺激减　弱，使多种维持神经元存活的重要蛋白不能随之　激活，由此引起神经元功能减退和神经元退行性　变¨　。本实验结果显示，Ｄ—ｇａｌ　３０ｍｇ／ｋｇ组和　６０ｍｇ／ｋｇ组神经元存活信号转导途径中Ｐ—ＡＫｔ的　活性明显降低，尤以Ｄ—ｇａｌ　６０ｍｇ／ｋｇ组变化明显，　说明半乳糖老化动物的海马神经元存在着Ｐ—ＡＫｔ　的表达障碍，这可能是参与老化的机制之一。　可靠的衰老模型应能较全面地模拟以上衰老　过程中发生的变化，以往Ｄ一半乳糖致衰老模型所　用的Ｄ一半乳糖剂量不等，且多采用某一方面的指　标评价模型的衰老程度，未能全面证明该模型的　可靠性。本实验采用３个梯级浓度的Ｄ一半乳糖　给予大鼠腹腔注射，８周后检测以上指标，结果表　明，Ｄ一半乳糖腹腔注射引起以上指标的变化与自　然衰老的变化一致；３种浓度的Ｄ一半乳糖均能使　以上指标发生不同程度的变化，但以６０ｍｇ／ｋｇ组　的变化最全面、差异最显著，说明采用Ｄ一半乳糖　６０ｒａｇ／（ｋｇ・ｄ）腹腔注射８周能使大鼠表现出与自　然衰老一致的变化，因而作者认为，该模型是较理　想的用于衰老研究和抗衰老药物等研究的动物　模型。　参考文献　１　Ｌｕ　Ｊ，Ｗｕ　ＤＭ，Ｚｈｅｎｇ　ＹＬ，ｅｔ　ａ１．Ｐｕｒｐｌｅ　ｓｗｅｅｔ　ｐｏｔａｔｏ　ｃｏｌｏｒ　ａｌｌｅｖｉａｔｅｓ　Ｄ　—－ｇａｌａｅｔｏｓｅ——ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｒａｉｎ　ａｇｉｎｇ　ｉｎ　ｏｌｄ　ｍｉｃｅ　ｂｙ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｖｉａ　ＰＩ３Ｋ　ｐａｔｈｗａｙ　ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｅｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ—ｍｅｄｉａｔ