表达序列标签研究进展及其在甲壳动物中的应用概况

表达序列标签研究进展及其在甲壳动物中的应用概况

摘要：随着生物信息学的发展，表达序列标签（ＥＳＴ）在分子标记开发、新基因分离鉴定、基因表达谱分析、基因组功能注释、基因电子克隆等方面具有重要作用。简要介绍了ＥＳＴ分析的原理及其在基因识别、基因预测、物理图谱的构建、ＤＮＡ芯片制备等方面的应用概况。综述了甲壳动物ＥＳＴ的研究现状，并对ＥＳＴ的应用前景进行了展望。

关键词：表达序列标签（ＥＳＴ）；甲壳动物；生物信息学

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ （ＥＳＴ） played ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ iｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｎｅｗ ｇｅｎｅｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｇｅｎｏｍｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｌｉｃｏ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ． Tｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ＥＳＴ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ

ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ iｎ ｇｅｎｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｇｅｎｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ， ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍａｐ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｃｈｉｐ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ was

briefly introduced． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｃｒｕｓｔａｃｅａｎ ＥＳＴ ａｎｄ the ｐｒｏｓｐｅｃｔ

ｏｆ ＥＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ（ＥＳＴ）； ｃｒｕｓｔａｃｅａｎ； ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ

表达序列标签（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ，ＥＳＴ）是从一个随机选择的ｃＤＮＡ克隆进行５’端和３’端单一次测序获得的短的ｃＤＮＡ部分序列。一个基因转录本的ｃＤＮＡ序列可能包含有多个序列重叠的ＥＳＴ，而一个基因ｍＲＮＡ剪接点不同可以获得多个ｃＤＮＡ克隆，因此ＥＳＴ既可能对应于一个ｃＤＮＡ的某一部分，又可能代表ｍＲＮＡ的不同剪接方式。此外，由于ＥＳＴ来源于一定环境下某种组织总ｍＲＮＡ所构建的ｃＤＮＡ文库，故ＥＳＴ也能说明该组织中各基因的表达水平及特异性。将所获序列与基因数据库中的已知序列进行比较，可以获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程相关的基因。

近年来，随着ＥＳＴ计划在不同物种间的展开和研究内容的深入，来源于不同物种、不同组织、不同细胞类型和不同发育阶段的表达基因序列的数目急剧上升。到２００３年６月，美国国家生物技术信息中心（ＮＣＢＩ）的ＥＳＴ数据库（ｄｂＥＳＴ）（ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳＴ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）中已录入的来自不同物种的不同组织的ＥＳＴ共有１７ ２９１ １２３条，到２００６年１０月，ＮＣＢＩ数据库中的ＥＳＴ共有３８ ９５３ １７８条，到２００９年３月，ＮＣＢＩ数据库中的ＥＳＴ增至

６０ ５０８ ９１５条，其中有关人和鼠的最多。

１ 表达序列标签的应用

随着基因组学的发展，ＥＳＴ技术已被广泛应用于分子标记、分离鉴定新基因、基因表达谱分析、基因组功能注释、基因电子克隆、制备ＤＮＡ芯片、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）技术的研究、寻找其他序列特征等研究领域。

１．１ 基因识别

ＥＳＴ已经被广泛应用于基因识别，因为ＥＳＴ的数目比ＧｅｎＢａｎｋ中其他的核苷酸序列多，研究人员更容易在ＥＳＴ数据库中搜寻到新的基因。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ等［１］通过果蝇黑胃Ｔｏｌｌ蛋白进行ｄｂＥＳＴ数据库检索，该蛋白已被证实在成熟果蝇抗真菌反应中发挥重要作用，通过同源分析的方法，找到相应的人类同源ＥＳＴ，这为接下来研究人类Ｔｏｌｌ同源蛋白的功能提供了很好的基础。

１．２ 基因预测

由于ＥＳＴ来源于ｃＤＮＡ，因此每条ＥＳＴ均代表了文库建立时所采样品特定发育时期和生理状态下的一个基因的部分序列。使用合适的比对参数，大于９０％的已经注释的基因都能在ＥＳＴ数据库中检测到［２］。ＥＳＴ可以作为其他基因预测算法的补充，因为它们对预测基因的交替剪切和３’端非翻译区很有效。

Ｂｏｕｌｔｗｏｏｄ等［３］通过对已有的ＥＳＴ数据库进行分析，得到了一个与５号染色体长臂缺失综合症相关的基因，并确定是二氢嘧啶酶相关蛋白家族的一个新成员。由于人类和小鼠的序列相似性较高，因此Ｂｕａｎｎｅ等［４］利用小鼠发育相关基因的序列搜寻人的ＥＳＴ数据库，发现了一个人的ＰＣ４同源基因，被命名为干扰素相关发育调节因子１，而且通过相似性比较确定了一个已知基因ＳＫＭｃ１５也是属于基因家族的成员，由此获得了一个新的发育相关基因家族。

１．３ 物理图谱的构建

ＥＳＴ可以借助于序列标签位点（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｔａｇｇｅｄ ｓｉｔｅｓ，ＳＴＳ）用于基因图谱的构建。ＳＴＳ本身是从人类基因组中随机选择出来的长度为２００～３００ ｂｐ的经ＰＣＲ检测的基因组中惟一的一段序列。来自ｍＲＮＡ的３’端非翻译区的ＥＳＴ更适合作为ＳＴＳ用于基因图谱的绘制，这主要是由于其没有内含子的存在，因此在ｃＤＮＡ及基因组模板中，其ＰＣＲ产物的大小相同，另外，与编码区具有很强的保守性不同，３’端非翻译区序列的保守性较差，因此很容易将单个基因与编码序列关系非常紧密的相似基因家族成员分开［５］。利用的３’端非翻译区序列和体细胞杂交技术，已经成功构建了人类基因组的部分遗传和物理图谱［６］。

１．４ 基因表达谱分析

因为ＥＳＴ序列是从某特定组织的ｃＤＮＡ文库中随机测序而得到的，所以可以利用未经标准化和差减杂交的ｃＤＮＡ文库ＥＳＴ分析特定组织的基因表达谱。标准化的ｃＤＮＡ文库和经过差减杂交的ｃＤＮＡ文库则不能反应基因表达的水平。

为了研究癌症的分子机理，美国国家癌症研究所（ＮＣＩ）的癌症基因组解析计划（Ｃａｎｃｅｒ gｅｎｏｍｅ aｎａｔｏｍｙ pｒｏｊｅｃｔ，ＣＧＡＰ）构建的很多正常的或是癌症前期的和癌症后期的组织的ｃＤＮＡ文库，并进行了大规模的ＥＳＴ测序，其中大部分的文库未经标准化或差减杂交处理。

Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ等［７］对利用ＥＳＴ进行基因表达分析的方法进行了改进，他们开发了通量更高的基因表达连续分析方法（ＳＡＧＥ），它是一种用于定量、高通量基因表达分析的试验方法，原理就是分离每个转录本特定位置的较短的单一序列标签（９～１４个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反映了对应基因的表达丰度。

１．５ 基因的电子克隆

电子克隆技术是以算法为核心，以计算机和互联网为工具，利用现有的ＥＳＴ和生物信息数据库，对其中大量ＥＳＴ进行分类、整合、组装，直接获得大片段或ｃＤＮＡ全长的方法。ＥＳＴ数据库的迅速扩张，使利用其来识别与克隆新基因迅猛发展起来。陈大福等［８］以果蝇腺苷酸转移酶基因ｃＤＮＡ序列作为模板，对家蚕ＥＳＴ数据库进行同源检索筛选，克隆出家蚕腺苷酸转移酶基因的ｃＤＮＡ序列。通过ＥＳＴ分析，还可用于预测基因结构［９］，挖掘ｍＲＮＡ加工和成熟的分子机制（如ｍＲＮＡ加工信号元件、可变剪接和３’末端加工的多样性等）［１０］及存在于同一物种个体之间的单核苷酸多态性（Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）信息［１１］。近来，将ＥＳＴ结合其他技术还可用于蛋白的鉴定，Ｅｄｗａｒｄｓ［１２］运用ＥＳＴ及序列数据库压缩的方法找到了一种迅速而有效鉴别蛋白的新方法。正是由于ＥＳＴ表现出了这些巨大潜能，才使其得到了充分的利用与发展。

１．６ ＤＮＡ芯片的制备

高密度寡核苷酸ｃＤＮＡ芯片或ｃＤＮＡ微阵列是一种新的大规模检测基因表达的技术，具有高通量分析的优点。在许多情况下，ｃＤＮＡ芯片的探针来源于３’ＥＳＴ［１３］，所以ＥＳＴ序列的分析有助于芯片探针的设计。随着更多基因组计划的实施和更多已知功能基因的累积，将来无需测序，只要通过ＤＮＡ芯片技术就可研究基因功能。ＥＳＴ计划的实施不仅获得了关于表达基因的信息资源，同时也获得了大量已鉴定的ｃＤＮＡ克隆资源，而这些资源都是功能基因组学研究不可缺少的。

２ 甲壳动物ＥＳＴ的研究概况

至２００９年３月，ＮＣＢＩ的ＥＳＴ数据库中已录入的来自不同物种的不同组织的甲壳动物ＥＳＴ序列共有６７８ ５８５条，其中十足目种类有３６７

１３８条，所涉及的种类和ＥＳＴ数目见表１。

ＥＳＴ技术在虾蟹等甲壳动物中的应用主要集中在基因的识别、预测、分子标记的开发以及基因表达图谱的构建上。Ｔａｓｓａｎａｋａｊｏｎ等［１４］对斑节对虾进行了大规模的ＥＳＴ测序分析，通过构建正常生理和胁迫条件下眼柄、肝胰腺、造血组织、血细胞、淋巴组织和卵巢ｃＤＮＡ文库，对１０ １００个克隆进行５’端单向测序，获得了４ ８４５条高质量的ＥＳＴ序列，发现了大量与免疫相关及组织特有的ＥＳＴ序列，如在眼柄ｃＤＮＡ文库中发现了两类该组织特有的ＥＳＴ序列——蜕皮抑制激素基因（ＭＩＨ）和色素扩散激素基因（ＰＤＨ），这两种基因对蜕皮、生殖、血糖浓度变化和色素迁移等生理活动具有重要的调节作用，是甲壳动物的神经分泌中心。这两类基因在Ｙａｍａｎｏ等［１５］对日本囊对虾（Ｍａｒｓｕｐｅｎａｅｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）眼柄ｃＤＮＡ进行的ＥＳＴ分析中也被发现。另外，通过对斑节对虾（Penaeus

mondon）ＥＳＴ的进一步分析，获得了９９７条微卫星序列。同时，Ｍａｎｅｅｒｕｔｔａｎａｒｕｎｇｒｏｊ等［１６］基于以上研究，通过ＥＳＴ技术，构建了斑节对虾的基因连锁图谱。Ｄｏｎｇ等［１７］通过对中国明对虾（Ｆｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）的ＥＳＴ分析，发现了许多与免疫相关的基因，包括不同类型的抗菌肽基因（如对虾素、抗脂多糖因子等）、酚氧化酶系统相关基因（如酚氧化酶酶原、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂等）、凝集相关基因（凝集素、转谷氨酰胺酶等）、信号传导相关基因（Ｐｅｒｏｘｉｎｅｃｔｉｎ、整合素等）。Ｇｒｏｓｓ等［１８］对凡纳滨对虾（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ）和白滨对虾（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ

ｓｅｔｉｆｅｒｕｓ）ＥＳＴ进行了详细的比较分析，也得到了２６８条可能编码４４种免疫相关基因的序列。Ｗｕ等［１９］对日本沼虾（Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｅ）进行了ＥＳＴ分析，获得了３ ２５６条高质量的ＥＳＴ序列，通过分析发现了２８个可能参与虾卵巢发育相关的基因。Ｃｏｂｌｅｎｔｚ等［２０］对蓝蟹（Ｃａｌｌｉｎｅｃｔｅｓ ｓａｐｉｄｕｓ）鳃和皮下组织的ｃＤＮＡ文库进行了分析，获得了１１ ７６１条高质量的ＥＳＴ序列。Ｌｉ等［２１］通过ＥＳＴ技术对草虾（Ｐａｌａｅｍｏｎｅｔｅｓ ｐｕｇｉｏ）的表达图谱进行了分析，结果发现，有些含ＥＳＴ的基因对胁迫因子具有特异性，比如，肌肉蛋白和谷胱甘肽过氧化物酶分别对草虾在慢性暴露和缺氧条件下表现为上调作用，而与硫氧化还原作用和半胱氨酸代谢相关的基因在缺