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地表水中浮游植物叶绿素a提取方法的改进研究

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鸣谢　该文得到重庆环境科学院生物组郑坚高级工程师、海南省环境科学研究院林彰文博士及吴国文高级工程师的指导和帮助,在此由衷感谢!

作者简介　冯青英(1957-),女,海南海口人,助理工程师,从事水质监测方法改进方面的研究。收稿日期　2007206207

地表水中浮游植物叶绿素a提取方法的改进研究冯青英1,唐怡2,李丽容3(1.海南省环境科学研究院,海南海口570206;2.海南师范大学生物系,海南海口570058;3.华南热带农业大学农学院,海南儋州571737)

摘要　[目的]优化地表水中浮游植物叶绿素a的提取方法。[方法]以新配制的90%丙酮为提取液,在低温与室温下反复地冻融浮游植物以破碎细胞,多次震摇后冷藏静置以提取叶绿素a,并与规范法进行对比。[结果]改进法提取的叶绿素a含量较规范法明显提高,且重复测定的精密度较高。两种方法的测定结果存在明显差异,但在含量测定的趋势上具有较强的一致性。改进法可以满足750nm处吸光值低于0.005的要求,而规范法不能。镜检表明,改进法的植物细胞破碎情况比规范法更佳。[结论]改进法提取浮游植物叶绿素a含量明显高于规范法且重复性较好,具有人为误差小、稳定性好、提取率高、结果准确、操作简便安全等特点。关键词　叶绿素a;反复冻融;细胞破碎率中图分类号　Q946 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2007)31-09902-03　

ImprovementofExtractionMethodofChlorophyllainPhytoplanktoninSurfaceWaterFENGQing2yingetal

(AcademyofEnvironmentalScienceofHainanProvince,Haikou,Hainan570206)Abstract　[Objective]Thestudyaimedtooptimizetheextractionmethodofchlorophyllainphytoplanktoninsurfacewater.[Method]Withnewprepared90%acetoneasextractionsolution,thephytoplanktonwasfrozenandmeltedrepeatedlytocrackthecellsatlowandroomtemperaturesandthenwasfrozentoextractthechlorophyll-aafterrepeatedlyshaking.Thismethodwascontrastedwithnormativemethod.[Result]Comparedwithnormativemethod,thechlorophyllacontentextractedbytheimprovedmethodwasincreasedobviouslyandtheprecisionofrepeateddeterminationwashigher.Therewassignifi2cantdifferencebetweenthedeterminationresultsofthetwomethods,butthestrongerconsistencyinthetrendofcontentdetermination.Theimprovedmethodcouldmeetabsorptionvalue,whichwaslowerthan0.005at750nm,however,thenormativemethodcouldn’tdoit.Themicroscopicexaminationindicatedthatthecrackingconditionofplantcellsbyimprovedmethodwasbetterthatthatbynormativemethod.[Conclusion]TheChlorophyllacontentinphytoplanktonextractedbytheimprovedmethodwassignificantlyhigherthanthatbynormativemethodandhadbetterrepeatability.Itpossessedcharac2terssuchaslittleartificialerror,goodstability,highextractionrate,accurateresult,simpleandsafeoperation.Keywords　Chlorophylla;Freezing2thawing;Cellbrokenrate

浮游植物中叶绿素a含量是衡量水体浮游植物生物量的重要指标,现广泛应用于水质评价和水体富营养化评价。目前,国内外报道的浮游植物叶绿素a的测定方法有多种。分光光度法因操作简便、可靠而被广泛采用。根据提取溶剂的不同,分光光度法分为丙酮法、乙醇法和DMF法[1]等。在《环境监测技术规范》和《湖泊富营养化调查规范》中,均采用丙酮法[2-3]作为常规监测方法。目前,国家环境保护总局《环境监测技术规范》(第四册)中“叶绿素a的测定方法”(下称规范法)在地表水环境监测中应用最为广泛。该方法的研磨过程费时、费力,提取过程繁琐且效率低,转移过程误差大,叶绿素a光降解的加大导致结果偏低。笔者根据有关文献的报道,在实际工作中进行了多次对比试验,对规范法的某些方面进行了改进。1　材料与方法1.1　样品采集　样品采自海南省海口市红城湖,于表层采样,采样量为1500ml。因叶绿素易发生光降解,所以样品采集后应立即用黑色塑料袋遮住。1.2　试验方法1.2.1　规范法。1.2.1.1　样品处理。样品采集后,立即加入1%碳酸镁(每升样品加1%碳酸镁1ml),以防止酸化引起色素波长偏移。1.2.1.2　样品浓缩。装好抽滤装置,在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜。加样品前,将样品充分摇匀后进行抽滤,抽滤时负压不能过大(约50kPa)。抽滤时用黑色袋子将样品罩住,样品抽滤后继续抽1～2min。1.2.1.3　样品提取。抽滤完毕后取下滤膜,将样品放入冰箱内低温干燥6～8h。然后,将滤膜放入研钵,并且加入少量碳酸镁粉末及2～3ml90%丙酮,充分手工研磨提取叶绿素a。用离心机3500r/min离心15min,将上清液转入10ml

比色管中,最后样品用90%丙酮定容至10ml,摇匀。1.2.2　改进法。1.2.2.1　样品采样和浓缩。与规范法相同。1.2.2.2　提取。抽滤完毕后取下滤膜,将滤膜夹在滤纸中放入-20℃冰箱中冷冻,每隔30min取出在室温中解冻15min,反复冻融[4]3次,使细胞完全裂解以利于叶绿素a的提取。将滤膜放入10ml比色管中,加入新配制的90%丙酮,定容,盖上塞子(在装有滤膜的比色管中先加入1ml蒸馏水再加入9ml丙酮)。振摇1～2min,放入4℃冰箱中静置,每隔30min取出振摇一次,反复操作3次。然后,3500

r/min离心15min,将上清液倒入10ml比色管中。1.2.3　测定。采用上述2种方法提取叶绿素a后,取上清液在分光光度计上,用1cm光程的比色皿,分别读取波长750、663、645和630nm处的吸光度,并以90%丙酮作空白。叶绿素a(mg/m

3)=[11.64×(D663-D750)-2.16×

(D645-D750)+0.10

×

(D360-D750)]V1/Vδ(1)式中,V为样品体积(L),D为吸光度,V1为提取液定容后的体积(ml),δ为比色皿光程(cm)。2　结果与分析2.1　规范法和改进法测定结果的比较　由表1可知,采用改进法所测得的叶绿素a含量明显高于规范法,且改进法重复测定的精密度较高。这主要是由于改进法简化了试验步骤,避免了样品在研磨和转移过程中的损失。相关性分析结果表明,改进法测定数据与规范法测定数据在0.01水平上显著相关,说明这两种方法在含量测定的趋势上具有较强的一致性。

安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2007,35(31):9902-9904责任编辑　理雪莲　责任校对　俞洁© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 表1采用规范法和改进法测定的叶绿素a结果mg/L

方法12345678910

规范法0.1380.1580.1960.1610.1660.1410.1690.1790.1160.189

改进法0.2410.2480.2810.2520.2790.2560.2650.2580.2370.243

2.2　规范法和改进法在750nm处吸光值测定结果的比较　叶绿素a测定时要求750nm波长吸光值低于0.005。由图1可知,在处理不当时规范法在750nm处吸光值有些无法达到上述要求,而改进法完全可以满足750nm波长处吸光值低于0.005的要求。2.3　镜检　通过镜检,发现原样品中主要含有微囊藻属(Microcystis)、平裂藻属(Merismopedia)、念珠藻属(Nosto)、裸藻属(Euglena)、鼓藻属(Cosmarium)、颤藻属(Oscillatoria)、栅藻属(Scenedesmus)、胶毛藻属(Chaetophora)、小环藻属(Cy2dotella)和囊裸藻属(Trachelomonas)等藻类。将2种方法提取叶绿素a后所剩残渣进行镜检,并且将该镜检结果与原样品镜检结果进行比较。 由图2～4可知,原液镜检可见到完整的植物细胞,研磨

后镜检未破碎的植物细胞较多,且很多藻类在研磨时细胞变形,但是叶绿素没有被提取出来。冻融法使得细胞破碎较完全,叶绿素提取率高。这说明改进法的植物细胞破碎情况比规范法更佳。在采回的样品中分别做了10次平行样的浮游植物细胞镜检。由表2可知,研磨的破碎率明显低于冻融的破碎率。

图1　A750处的吸光值比较图2　原液细胞　注:红色圈标明的为未完全破碎的浮游植物细胞。下同。图3　研磨细胞

图4　反复冻融细胞

309935卷31期　冯青英等　地表水中浮游植物叶绿素a提取方法的改进研究

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探讨分光光度法测定水中叶绿素a的方法改进

探讨分光光度法测定水中叶绿素a的方法改进


１ ０ ． ８ ２
０ － ０ ０ ９ ２ ０ ５ ＝ ０ ． ０ ４ ２ ０ ｏ ＝ ０ ． ０ ３ ３
２月
０ Ｄ 晡 ３ － ０ ． ０ ５ ４
０Ｄ ６ ． ｓ ＝ Ｏ ． ０ １ ６
Ｏ ０ － ０ ． ｏ １ ４ ＯＤ Ｔ ￣－ Ｏ ． ０ ０ ２
５ ６
７
Ｏ ｎ 坼 ３ ＝ ０ ． ０ ４ ９
０ ０ ０ ｌ ９
４ ３ ５
２３ ．３
∞ ０ － ０ ０ １ ６ ０ ０ ７ ｏ － ０ ０ １ ０
表 Ｉ两种方法空 白试验比较
测试方法 吸光度值 叶绿素值
１前 言 随 着现 代 经 济 的 高 度 发 展 和 人 口膨 胀 ，湖 泊 、 水 库 正 接 纳 越 来
０ Ｄ ７ ５ ０ ０ Ｄ ６ ６ ３ Ｏ Ｄ ６ ４５ Ｏ Ｄ ６３ ０ （ ｍ ｇ ／ Ｌ） 越 多的氮 、磷 等营养负荷 ，也使得浮游生物及其他水生生物异 常繁 方法 Ｉ １ ０ ． ０ ０ １ ０ ． ０ ０ ２ ０ ０ ０ １ ０ ０ ０ １ ＜ １ 殖 ，造 成水体 富营养化，严重影响供水水质 。藻类计数和 叶绿 素含 方法 １ ０ ０ １ ０ ０ ． ０ １ ４ ０ ． ０ １ ２ ０ ． ０ １ １ ０ ４ 量的测 定是 用于评价水体富营养化水平 的两大生物水质检测 指标， 从 这 个 实 验 结 果 得 出： 而 方 法 Ｉ Ｉ 正是 通 过 微 过 滤 来 降 低 浊 度 影 利用 显微镜 对水中藻类计数耗时长 、检测人员存在主观判 断差异不 同 ， 测 得 的 藻 类 计 数 结 果 往 往 相 差 较 大 。 叶绿 素 测 定 受 人 为 主 观 判 响 ， 起 到 了 很好 地 控 制 作 用 。 （ ２ ）本 文 以董 铺 水 库 原 水 为 例 ，测 定 叶 绿 素 ａ含 量 ，通 过 多次 断影 响 相对 较 小 ， 含 量 比较 稳 定 ， 因此 ，成 为 评 价水 质 富 营 养 化 水 调查研究实验，对 ２ ０ １ ４年 １月￣２ ０ １ ４年 ３月 间五组数据进行方法 平的主要水质指标。 试 验 比对 ， 结 果 如 下 ： ２叶绿素测定新方法 表 ２ 两种方法 数据对 比实验结果 本文是根据 《 中国湖泊富营养调查 规范》 、《 水与废 水标准检验 方法》第四版等资料提供 的操作方 法，在 不改变原方法的基础上 ， ＼董 铺 对舍 藻水样经过过滤浓缩 、冷冻萃 取、超声波 振动、再对离心后的 ｝ 方法 Ｉ Ｉ 方法 Ｉ 误差 （ 水样进行再过滤 ，通过分光光度计 测定萃取液中叶绿素的浓度 。通 ％） 过反复试验 ，取得 了较好 的试验结 果。同原方法相比较，叶绿素测
浅析地表水叶绿素a的测定

浅析地表水叶绿素a的测定

浅析地表水叶绿素a的测定地表水叶绿素a（Chlorophyll-a）是一种重要的水生生物指示剂。

它是绿色植物和蓝藻中光合作用的关键分子，同时也是水生生物的重要营养来源。

因此，地表水叶绿素a的浓度变化对生态系统健康和水体污染等问题具有重要的指示作用。

本文将从测定方法和测定误差两个方面入手，对地表水叶绿素a的测定进行浅析。

一、测定方法1. 常规分光光度法常规分光光度法是目前应用最广泛、最常见的测定方法。

该方法是基于叶绿素a的吸光特性进行测量，通过测量地表水样品中的吸光值，计算出叶绿素a的浓度。

这种方法的优点是简单、易操作，同时能够得到较为准确的结果。

2. 高效液相色谱法高效液相色谱法是一种比分光光度法更加精确、敏感的测定方法。

该方法通过对水样中的叶绿素a进行提取和分离，然后对其进行色谱分析，计算出叶绿素a的浓度。

这种方法的优点是精确度高，可以检测出较低浓度的叶绿素a，但缺点是操作复杂且设备成本较高。

3. 激光诱导荧光分析法二、测定误差无论采用哪种测定方法，地表水叶绿素a的测定都存在一定的误差。

主要来源包括以下几个方面：1. 提取方法的不同叶绿素a的提取方法对测定结果具有重要影响。

不同的提取方法可能导致不同的提取率和提取效率，从而影响叶绿素a的测定结果。

2. 标准曲线的制备标准曲线的制备对测定结果具有决定性影响，因此需要制备准确可靠的标准曲线。

制备标准曲线时应注意使用合适的标准物质，遵循标准曲线的制备规范操作，以获得准确可靠的测定结果。

3. 仪器的精度和故障测定仪器的精度和故障也会对测定结果造成影响。

仪器出现故障或者精度较低时，会导致测定结果的误差增大。

4. 消解时间和温度的控制叶绿素a样品在消解过程中需要遵循一定的时间和温度条件。

如果消解时间过长或温度过高，会导致叶绿素a分解，从而导致测定结果不准确。

综上所述，地表水叶绿素a的测定方法和误差控制都需要重视。

通过合适的测定方法、准确可靠的标准曲线、精密的仪器以及严格的操作控制，可以获得较为准确可靠的测定结果。

关于叶绿素提取实验方法的改进

关于叶绿素提取实验方法的改进


槐、 观 赏碧 桃 、 菠 菜和 芹 菜叶 片 作 为 实验 材 料 。 用丙酮、 乙醇 作
为提 取 溶 剂 对 叶 绿 素 进 行提 取 并 做 含 量 测 定 结 果 表 明 ， 四 种 材料 中， 洋槐 叶 片 叶绿 素 含 量 最 高 。丙酮 和 乙醇 对提 取 叶 绿 素 含 量 影 响 差异 不 大 ， 所 以 可 以 用 乙醇代 替 丙 酮提 取 叶 绿 素 ， 既
关 于 叶 绿 素 提 取 实 验 方 法 的 改 进
王 岚１ ， ２ 付 素静 １ ， ２ 龙梅 珍 １
（ １ 铜 仁学 院 生 物科 学 与化 学 系 ， ２ 梵 净 山 野生 动 植 物 资 源 保 护 与利 用 研 究 中心 ， 贵州 铜仁 ５ ５ ４ ３ ０ ０ ）
摘 要 ：作 者 对 叶 绿 素提 取 实验 进 行 了 改进 。 分 别 用 洋
萋
图３ 不 同提 取 材 料 和溶 剂 时 叶 绿 素 的含 量
３ ． 结 论
墨
用丙酮作为提取溶剂时 ， 洋 槐 叶 的 叶绿 素 含 量 最 高 ； 用 乙 醇 作 为 提取 溶 剂 时 ， 也 是洋 槐 叶 的 叶绿 素 含 量 最 高 ； 所 以 在选
组． 这 样 有 助 于 学 生仔 细地 观察 实验 现 象 ， 有 助 于 学 生 自主 学 习 能 力 的培 养 。教 师 还 可 以把 一 些 演 示 实 验 变 为 学 生 自主 探 究 实 验 。教 师创 设 好 教 学 情 境 ， 营造 出探 究 的氛 围 ， 让 学 生 变 身为“ 小科学家” 去发现“ 新” 的现 象 ， 再 根 据 现 象 进 行 综 合 分 析推理 ， 总 结 出 隐 藏 在 现象 后 面 的 本 质 。 这样 ， 不 仅 能 培 养 学 生观察 、 思维 、 动手等方面的能力 ， 而 且 能 加 深 学 生 对 相 关 知 识的理解 ． 潜 移 默 化地 激 发 学 生 的 创 新 潜 能 。 总之 ， 提 高 学 生 自主 学 习 能 力 绝 非 是 一 朝 一 夕 的 事 情 ， 但 我们坚信 ． 培 养 学 生 自主 学 习 的 习 惯 ， 教 给学 生 自主学 习 的方 法 ．是 培 养 学 生 自主 学 习 能力 的重 要 途 径 。 只要 我们 坚持 下 去． 学 生 的 自主 学 习 能 力就 一 定 会 逐 渐 提 高 。 参考文献 ： ［ １ ］ 沈 红英 ． 初 中学 生 化 学 自主 学 习的 调查 及 优 化 策 略 ［ Ｊ ］ 化 学教 与 学 ， ２ ０ １ ３ ， （ １ ） ， ７ １ — ７ ３ ．
浮游植物叶绿素a 含量测定方法的比较测定

浮游植物叶绿素a 含量测定方法的比较测定

浮游植物叶绿素a 含量测定方法的比较测定X陈宇炜高锡云(中国科学院南京地理与湖泊研究所, 南京210008)提要本文比较研究了浮游植物叶绿素A含量测定的2 种常用方法——国内常用的丙酮萃取分光光度法和国际上较通用的热乙醇萃取分光光度法. 实验结果显示, 热乙醇法具有操作简便、快捷, 萃取完全, 低毒害等优点. 两种方法有显著统计差异及很好的相关性, 其回归方程为: Ch la乙醇= 1. 261 Ch la丙酮- 3. 5 (R =01998).关键词浮游植物叶绿素a丙酮萃取法热乙醇萃取法分类号Q 945. 11浮游植物的主要光合色素是叶绿素(Ch lo rophyll) , 常见的有叶绿素a、b 和c. 叶绿素a 存在于所有的浮游植物中, 大约占有机物干重的1- 2% , 是估算浮游植物生物量的重要指标[1, 2 ]. 浮游植物细胞内叶绿素a 含量随种类或类群而有所不同, 同时还受年龄、生长率、光和营养条件的影响[3 ].浮游植物叶绿素a 的测定方法主要有分光光度法[4 ]和荧光法[5 ]两种. 荧光法具有较高的灵敏度, 但需要荧光光度计等设备, 在此不作讨论. 分光光度法又分为三色法和单色法两种. 过去通常采用三色法, 但由于结果计算较粗, 误差大, 现已较少采用. 目前大多采用Lo renzen 提出的单色法, 此法只测定叶绿素a, 幵对脱镁叶绿素a 的干扰进行了校正[4 ]. 根据萃取溶剂不同Lo renzen 单色法又分为丙酮法和乙醇法, 我国多年来一直使用丙酮法. 近年来国际上从萃取效果、安全和保健等考虑, 已逐渐改用乙醇法, 而国内考虑到资料的可比性, 仍继续使用丙酮法[6 ]. 本研究正是在此基础上, 进行了丙酮法与乙醇法的比较, 为引进乙醇法, 以使国内叶绿素a 测定结果能与国际上高水平研究结果进行比较而提供科学的参考意见.1方法1. 1水样的采集、处理和保存根据章宗涉等的“淡水浮游生物研究方法”和金相灿等的“湖泊富营养化调查规划”所述方法采集幵处理水样[122 ] , 取合适体积水样经滤纸(W aterman GFöC 玻璃纤维滤纸或国产微孔滤膜) 过滤后, 将带样品的滤纸放入冰箱冷冻室保存, 若置于低温冰箱(- 20℃) 中, 则可较长期(三个月) 保存样品.1. 2丙酮萃取分光光度法(丙酮法) 简易步骤参照“淡水浮游生物研究方法”和“湖泊富营养化调查规范”, 取带样品的滤纸剪碎后在研钵中加适量90% 丙酮研磨至足够细, 移入具塞刻度试管中于暗处静置萃取6- 20h 后, 过滤或离心得清液定容, 721 或752型分光光度计于波长665nm 和750nm 处测吸光值, 然后加入几滴1mo l·L - 1盐酸酸化, 于波长665nm 和750nm 处再测吸光值[7 ] , 结果计算公式为:Ch la丙酮= 27. 3×[ (E 665- E 750) - A 665- A 750) ]×V 丙酮öV水样其中, Ch la丙酮为丙酮法测定的叶绿素a 含量(L g·L - 1) ; E 665为丙酮萃取液于波长665nm 的吸光值; E 750为丙酮萃取液于波长750nm 的吸光值; A 665为丙酮萃取液酸化后于波长665nm 的吸光值; A 750为丙酮萃取液酸化第12 卷第2 期2000 年6 月湖泊科学JOU RNAL O F LA KE SC IENCESVo l. 12,No. 2Jun. , 2000X 国家自然科学基金项目(39600025)、中国科学院重大项目(KZ951- B1- 205- 02)、中国科学院重点项目(KZ952- S1- 220) 和中国科学院“九五”特别支持项目(KZ95T- 04- 04) 联合资助.收稿日期: 1999- 07- 02; 收到修改稿日期: 2000- 03- 03. 陈宇炜, 男, 1969 年生, 助理研究员.。