环糊精葡萄糖基转移酶的基因改造与高效表达_夏亚穆

CGTase 作为一种生物 催 化 剂，不 只 生 产 α，β，γCD，在其他领域也有应用。Jemli 等［8］报道在面包烘焙 前加入 CGTase 不仅能显著增加成品面包的体积，而且 减轻面包在贮藏过程中的硬化。另外，CGTase 也可用 于食品添加剂和功能性成分的改性。早在上世纪 90 年代，人们就利用了 CGTase 耦合与歧化活性，将葡萄 糖基连接至橘皮苷上。自此，CGTase 的转糖基活性的 研究越来越多。利用 CGTase 转糖基的活性得到葡萄 糖基，不仅去 除 了 本 身 的 涩 味，其 溶 解 性 也 增 加，现 已 成为一种成功的商品甜味剂。另外芦丁经 CGTase 糖 基化后得到 的 芦 丁 衍 生 物 葡 萄 糖 基 芦 丁，水 溶 性 和 稳 定性都得到提高［9］。近年来，人们还利用 CGTase 成功 地合成了表 面 活 性 较 强 且 无 毒 副 作 用 的 烷 基 糖 苷，它 是一种性能优良、可生物降解的洗涤剂，若能工业化生 产，在一定程度上能够缓解环境污染问题，必定会有巨 大的应用潜力。另外，利用 CGTase 的水解活性处理淀 粉会产生特 殊 的 极 限 糊 精，该 物 质 能 改 善 纸 张 的 表 面 上胶与涂层性能，已应用于工业化。
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中国生物工程杂志 China Biotechnology
Vol． 35 No． 2 2015
定 性 高 的 CGTase （ 最 适 温 度源自文库 90℃ ） ； Go 等［5］ 从 Alkalophilic Bacillus sp． BL-31 分离得到的新 β-CGTase， 具有专一 性 强 的 分 子 间 类 黄 酮 转 糖 基 作 用； Atanasov 等［6］、Kitayska 等［7］ 从 Bacillus pseudalcaliphilus 8SB 分 离得到一种新 CGTase，可高收率转化淀粉为 β-CD 和 γ-CD［6-7］。 1． 2 CGTase 的应用
2 基因改造改善 CGTase 的性质
自首次成功获得 Bacillus macerans 中的 CGTase 基 因片段以来，已有 30 多个 CGTase 基因片段得到证实， 同时蛋白质工程的发展给分子生物学的研究指出新的 方向。目前，工 业 生 产 环 糊 精 遇 到 的 最 主 要 困 难 是 原 料利用率低，要解决这个问题要从两个方面考虑，一是 从自然中筛选高转化率的 CGTase，但是该方法所需时 间久，效率较低。另一个方法就是改造已有的 CGTase 基因，人工选育出能高效转化原料的酶。此外，利用基 因改造也 可 以 改 善 CGTase 的 其 他 特 性，例 如 热 稳 定 性、水解活性等。 2． 1 定点突变改善 CGTase 性质
中国生物工程杂志 China Biotechnology，2015，35（ 2） ： 105-110 DOI： 10． 13523 / j． cb． 20150216
环糊精葡萄糖基转移酶的基因改造与高效表达
夏亚穆 李晨晨*
（ 青岛科技大学 化工学院 青岛 266042）
摘要 环糊精葡萄糖基转移酶（ CGTase，EC 2． 4． 1． 19） 是一种多功能酶，主要用于生产环糊精 （ CD） 、糖基化碳水化合物，同时在食品行业也有重要作用。为改善 CGTase 在这些方面的应用性 能，筛选出优势突变酶，异源表达、定点突变、固定化等技术被研究和应用，取得了实质性的进展。 综述了 CGTase 基因高效异源表达策略，概述了基因改造 CGTase 的研究进展，并且还总结了用于 改造 CGTase 的其他手段，例如固定化酶、嵌合酶、化学添加剂等，以期为在相关 CGTase 研究领域 开展研究提供参考。 关键词 环糊精葡萄糖基转移酶 环糊精 异源表达 定点突变 分子工程 中图分类号 Q789
收稿日期： 2014-11-04 修回日期： 2014-12-04 * 通讯作者，电子信箱： 523530756@ qq． com
般低于 50 U / ml 等。随着对其作用机制、分子结构及 3D 结 构 的 研 究 深 入，人 们 已 经 发 现 50 多 个 不 同 CGTase 晶体结构，为分离获取具备特殊性质从而更好 地满足工业生产的 CGTase 菌株提供基础［2］。研究人 员对 CGTase 的 研 究 集 中 在 筛 选 高 效、高 专 一 性 的 CGTase，在此基础 上 进 行 分 子 改 造、异 源 表 达、固 定 化 等，期望得到 更 适 于 工 业 应 用 的 优 势 酶。 本 文 介 绍 了 新发现的 CGTase 及新性状和新用途，对 CGTase 基因 高效表达与分子工程策略等相关研究进展进行综述， 并结 合 现 有 资 源 与 技 术 指 出 当 前 研 究 的 不 足，对 CGTase 未来的研究指出方向。
尽管 CGTase 是 α-淀粉酶的一种，但其水解活性较 其环化 活 性 低 得 多。 Veen 等［14］ 发 现 CGTase 中 Phe （ 183、259） 的疏水作用限制该酶的水解活性，通过改变 某些残基的极性得到的 CGTase 突变型 F183S、F183N、 F259N、和 F259S，它们的水解活性增加，转糖基活性降 低。特别是一些像 F183S / F259N 的双突变体，水解活 性是环化活性的 15 倍。由 B． stearothermophilus ET1 所 获得的 CGTase 突变菌株 A230v，酶的水解活性比野生 型菌株提高了 90 倍。未来我们可以利用筛选出的这 些高水解活性的菌株，代替一些水解酶，发挥特定的水 解作用。 2． 5 定点突变提高 CGTase 的热稳定性
VC 不稳定，易丧失生理活性。人们利用 CGTase 的 转糖基作用，将葡萄糖基转接于 L-抗坏血酸的 C2 上， 得到稳定的 VC 衍生物 2-O-葡萄糖基-L -抗坏血酸（ AA2G） ，在体内可发挥 VC 的多种生理功能，但常用的糖基 供体 α-CD 价格昂贵、β-CD 溶解性不好，限制了 AA-2G 的生产。因此，人们需要找到 AA-2G 合成中价格低廉 的糖基供体代替 α-CD 和 β-CD。Yamamoto 等［12］研究 发现，对 CGTase 赖氨酸 47 突变处理，得到突变型 K47F （ Lys-Phe） 、K47P （ Lys-Pro） 、K47Y （ （ Lys-Tyr） ，它 们 利 用麦芽糖糊精生产 AA-2G 的产率较野生型分别提高了 17． 1% 、32． 9% 、21． 1% ，优化转化条件后，K47P 产 AA2G 最高达 1． 12 g / L，是野生型 CGTase 的 1． 32 倍（ 0． 85 g / L） 。 另 外，许 乔 艳 等［13］ 对 Paenibacillus macerans CGTase 的 + 1 亚位点附近的氨基酸残基进行定点饱和 突变得到 3 个优势突变体 L194N（ Leu→Asp） 、A230D （ Gla→Asp） 、H233E（ His→Glu） ，既提高了其对麦芽糊
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精的底物特异性，又提高合成 AA-2G 的效率。研究发 现突变体底物特异性的改善可能与 CGTase 第 194 位、 230 位和 233 位的氨基酸残基的亲水性及与底物分子 间的作用力的改变有关。 2． 4 定点突变提高 CGTase 水解活性
CGTase 催化淀粉生成环糊精，多以 α-、β-、γ-CD 三 种混合物的形式存在，对 CD 的产率和后提取工艺皆造 成不利影响。因此，对 CGTase 基因进行改造，提高催 化产物的专一性对其工业化生产至关重要。Li 等［10］用 Arg、Pro、Thr、Ser 和 Gly 取代 B． circulans STB01 CGTase 钙结合位点 I（ CaI） 附近的 Ala31，得到的 A31Ｒ、A31P 和 A31T 三种突变体产 β-CD 特异性增加。尤其是突变 体 A31Ｒ，β-CD 的 产 量 增 加 了 26% 。 另 外 将 CGTase195 位 Tyr 进行突变得 Y1951，在大肠杆菌 BL21 中异源表达，和野生酶相比，突变酶 Y1951 的催化产物 中，α-CD 的含量由 68% 降为 30% ，β-CD 由 22． 2% 提 高为 33． 3% ，而 γ-CD 含量提高了 4 倍由 8． 9% 提高为 36． 7% ，达 1． 1g / L，并且发现，突变酶 Y1951 比野生酶 具有 更 好 的 pH 稳 定 性，具 有 生 产 制 备 γ-CD 的 潜 力［11］。一系列的研究表明钙结合位点 I（ CaI） 、环化中 心、-3 亚位点、-7 亚位点等活性较高的位点的突变更有 可能得到产物特异性高并符合工业生产的优势菌。 2． 3 定点突变提高 CGTase 底物特异性
在对 CGTase 进行详细结构分析的基础上，通过定 点突变的方 法 获 取 强 专 一 性、稳 定 性 和 水 解 活 性 高 的 CGTase。通常会先分析底物-酶结合物的晶体结构，找 出关键作用 位 点，再 利 用 基 因 改 造 的 方 法 替 换 关 键 位
点的氨基酸，再分析相应产物的变化，筛选出优势突变 体。所选的突变 对 象 主 要 是 在 保 守 性 较 差 的 亚 位 点 处，如活性区域-3 亚位点（ 47 位赖氨酸残基） ，-7 亚位 点（ 146 ～ 152 位氨基酸残基） 以及环化中心位点（ 195 位酪氨酸残基） 等。迄今为止，定点改造 CGTase 基因 已经得到了 一 些 优 势 突 变 酶，但 是 这 些 酶 仍 不 能 都 应 用于工业化生产中，对其改造工作仍需进一步研究。 2． 2 定点突变提高 CGTase 产物特异性
1 新 CGTase 的性质和应用
1． 1 新 CGTase 的性质 自 然 界 中 产 CGTase 的 微 生 物 主 要 为 Bacillus、
Paenibacillus、 Klebsiella、 Thermoanaerobacterium、 Thermoanaerobacter 等［3］。不同来源的 CGTase，由于宿 主的蛋白质合成、修饰和转运过程各自不同，其性质差 别很大。已发现的 CGTase 仍不能达到工业化生产的 条件，人们 仍 需 努 力 探 索，筛 选 出 性 状 新 和 特 性 优 的 CGTase。最近研究人员利用基因改造和异源表达策略 发现新 CGTase 基因序列及它们表现出的一些新性质。 Lee 等［4］在 Pyrococcus furiosus 中发现新 CGTase 基因序 列，然后把该基因转入 Escherichia coli 表达，得到热稳
环糊精因其独特的理化性质不仅用于食品行业， 在医药、化妆品、环境保护等诸多领域也有着非常广泛 的应用，其工业化生产将具有重要意义。目前，世界上 生产 CD 的 国 家 主 要 有 匈 牙 利 的 Cyclolab、法 国 的 Csestar、德 国 的 Wacker Biochem 以 及 日 本 的 Ensuiko Suger，但是由于工 业 化 制 备 环 糊 精 的 过 程 影 响 因 素 众 多并且难以把握，在其工业生产中仍存在很大问题，例 如原料转 化 率 一 般 在 50% ～ 60% 、CGTase 热 稳 定 性 差、糖基供体价格昂贵、筛选的 CGTase 产生菌酶活一
环糊精葡萄糖基转移酶（ CGTase，EC 2． 4． 1． 19） 是 α-淀粉酶家族 的 重 要 成 员，能 催 化 环 化、耦 合、歧 化 和 水解这四种反应［1］。环化反应生产环糊精是其特征反 应，CGTase 催化淀粉的 α-糖苷键断裂，供体的一部分 被分离出来作为受体形成 CD。耦合反应是环化反应 的逆反应，CD 环的 α-糖苷键断裂，得到的低聚麦芽糖 转移到受体底物上。歧化反应是直链低聚麦芽糖的一 个 α-糖苷键断链，然后把它的一部分转移到受体底物 上。水解反应是水分子作为受体，催化底物水解，形成 低聚糖。在 CGTase 的四种反应中，环化、耦合、歧化是 转糖基作用，活性较高； 水解作用的活性通常较低，并 且控制 CGTase 的水解活性将有利于环糊精的生产，工 业生产中主要是利用 CGTase 的转糖基作用。