海带岩藻多糖的水提制备及其抗氧化活性研究
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101※工艺技术食品科学2010, Vol. 31, No. 06
海带岩藻多糖的水提制备及其抗氧化活性研究程仕伟，陈超男，冯志彬，张玉香(应用生物技术山东省重点实验室，鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025)
摘 要：以热水浸提后乙醇沉淀的方法从海带中提取制备岩藻多糖。通过单因素试验和正交优化试验确定最佳提取工艺，可获得岩藻多糖最大提取率为4.99%，硫酸-苯酚法测定多糖的含量为96.9%。多糖提取物对羟自由基、超氧阴离子自由基的清除作用，还原力测定以及在模拟胃液条件下对NO2的清除实验结果表明，海带中岩藻多糖提取物具有较强的体外抗氧化性能，且随着多糖质量浓度的增大，其抗氧化活性整体呈逐渐增强趋势。关键词：岩藻多糖；海带；提取；抗氧化
Water Extraction and Antioxidant Activity of Fucoidan from Laminaria japonicaCHENG Shi-wei，CHEN Chao-nan，FENG Zhi-bin，ZHANG Yu-xiang(Key Laboratory of Applied Biotechnology in Shandong Province, College of Life Science, Ludong University,Yantai 264025, China)
Abstract ：Hot water extraction followed by ethanol precipitation was used for production of fucoidan from Laminaria japonicain this study. To maximize fucoidan yield, the optimal values of crucial parameters of hot water extraction, including extractiontemperature and time and material/liquid ratio were determined by single factor and orthogonal array methods to be 70 ℃, 6 h and1:40, respectively. Under the above conditions, the maximum yield of fucoidan with 96.9% purity was up to 4.99%. Laminariajaponica fucoidan had strong antioxidant performance in vitro, which was reflected by hydroxyl and superoxide anion free radicalscavenging activities, reducing power and nitrite scavenging activity under simulated gastric environment, and its antioxidantperformance in vitro exhibited a gradual increase with its increasing concentration.Key words：fucoidan；Laminaria japonica；extraction；antioxidant中图分类号：S946.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)06-0101-04
收稿日期：2009-05-28基金项目：鲁东大学科研基金项目(LY20083305)作者简介：程仕伟(1976—)，男，讲师，博士，研究方向为生物活性物质开发。E-mail：swbiotech@yeah.net
岩藻多糖又称褐藻糖胶、岩藻多糖硫酸酯，是存在于所有褐藻中的一种水溶性杂多糖，其主要成分除了L-岩藻糖和硫酸根外，还含有半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸等[1]。研究表明，岩藻多糖具有广泛的生理生化活性，既有抗病毒、抗凝血和抗血栓作用，还具有抗肿瘤、抗辐射、抗疲劳、抗氧化、降血脂、调节免疫等多种功效[2-3]。生物体在新陈代谢过程中会不断的产生各种自由基，适量自由基对细胞的分裂、生长、消炎、解毒等起积极作用。但是自由基过多或清除过慢会使生物大分子受到攻击，加速机体的衰老进程，并诱发炎症、恶性肿瘤、免疫失调等多种疾病[4]。为了抑制自由基损伤，人工合成的抗氧化剂被大量应用于食品、化妆品和医药等领域，但长期摄入合成抗氧化剂可导致肝损伤并诱发恶性肿瘤[5]，所以开发安全的天然抗氧化剂取代
人工合成抗氧化剂成为当前研究的热点。天然多糖类化合物对物理、化学以及生物等因素产生的自由基具有清除作用，有望作为天然抗氧化剂使用[6]。本实验对海带中岩藻多糖提取条件进行优化，并对其体外抗氧化活性进行测定，期望为其作为天然抗氧化剂的开发利用提供参考。
１材料与方法1.1材料、试剂与仪器干海带(产自烟台) 市购；化学试剂均为分析纯。粉碎机 天津泰斯特仪器公司；电热恒温水浴锅 潍坊医疗器械厂；722分光光度计 四川仪表九厂；电热鼓风干燥箱 上海实验仪器厂；pH计 上海雷磁公司。1.2方法 2010, Vol. 31, No. 06食品科学※工艺技术1021.2.1岩藻多糖提取清水浸泡海带，去除表面杂质，50℃干燥箱中干燥至恒重后用粉碎机粉碎，过100目筛，备用。称取5g海带粉，以不同料液比(g/mL)加入水混匀，在不同温度条件下提取多糖。操作完毕后离心取上清液，加95%乙醇溶液至乙醇终体积分数为30%，3000×g离心除水溶性褐藻胶沉淀。取上清液，再加入95%乙醇至其终体积分数为75%，5000×g离心收集岩藻多糖粗沉淀[7]。粗多糖沉淀用蒸馏水重新溶解，加入三氯乙酸至其终质量浓度为3g/mL，静置过夜，离心去蛋白沉淀。上清液加入95%乙醇溶液至乙醇终体积分数为75%，离心收集多糖沉淀。用无水乙醇洗涤多糖样品，烘干后即得岩藻多糖。以获得的多糖干重除以总样品质量作为多糖提取率。
1.2.2多糖含量测定苯酚-硫酸法测定多糖含量[8]。以葡萄糖为标准糖绘制标准曲线，标准曲线：y=0.0034x－0.0016，R2＝0.9996。称取0.25g提取多糖，溶于100mL蒸馏水。多糖溶液稀释一定倍数，按标准糖的测定方法测吸光度，通过标准曲线方程计算样品中多糖含量。
1.2.3岩藻多糖的抗氧化活性分析1.2.3.1多糖提取物清除羟自由基参考Smirnoff等的方法[9]，并略有改动[10]。FeSO4
与H2O2反应产生・OH，以・OH氧化水杨酸所得产物
的吸光度表示・OH的多少，吸光度越大，・OH越多。样品组中含有0.15mol/L FeSO4、2mmol/L水杨酸钠、6mmol/L H2O2和不同浓度的多糖，对照组用蒸馏水代替多糖，本底组以蒸馏水代替水杨酸钠。37℃水浴1h，5000×g离心后取上清液，以蒸馏水调零，于波长510nm处测定吸光度。按下式计算清除率：
A0－(A－Ai)
E/%=———————× 100
A0
式中：E为清除率；A0为对照组吸光度；A为样品组吸光度；Ai为本底组的吸光度。
1.2.3.2多糖提取物清除超氧阴离子自由基采用邻苯三酚自氧化法[11]。邻苯三酚在碱性条件下自氧化，释放O2・，生成有色中间产物，可用分光光度计测定。清除剂可以清除O2・，进而邻苯三酚的自氧化速率降低。取pH8.2(50mmol/L)缓冲液2.8mL，加0.1mL不同质量浓度的多糖溶液，25℃平衡10min，加入预温的邻苯三酚(60mmol/L)0.1mL，混匀。反应3min后，加入5g/100mL的抗坏血酸0.05mL终止反应。10min后在420nm处测定吸光度。以等体积10mmol/L HC1代
替邻苯三酚溶液为空白调零，对照组以等体积水代替岩藻多糖样品。按下式计算清除率：
A0－A
E/%=————× 100
A0
式中：E为清除率；A0为对照组吸光度；A为样品组的吸光度。
1.2.3.3还原力测定 参照Oyaizu[12]的方法测定，样品将铁氰化钾还原成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾与Fe3+作用，生成普鲁士蓝，于700nm波长处检测普鲁士蓝的吸光度，吸光度越高表示样品的还原力越强。取pH6.6的缓冲液和1%的铁氰化钾溶液各2.5mL，加入不同质量浓度的多糖溶液1mL，混匀后50℃水浴20min。加入10g/100mL三氯乙酸溶液2.5mL，混匀，5000×g离心10min。取上清液2.5mL，加入蒸馏水和0.1g/100mL的氯化铁各2.5mL，混匀，静置10min后测定吸光度。
1.2.3.4模拟胃液条件下NO2清除实验采用盐酸萘乙二胺比色法[13]，略有改动[10]。弱酸性溶液中NO2与对氨基苯磺酸生成重氮化合物，与萘基盐酸二氨基乙烯偶联后生成紫红色重氮染料，其颜色深浅与NO2含量呈正比。不同浓度的多糖溶液1mL，加入0.2g/L的NaNO2标准液0.1mL，同时做不加NaNO2的本底管，用pH3.0缓冲液加至5.0mL，混匀置37℃水浴中避光保温1h。以空白调零，测定吸光度。按下式计算清除率：
A0－(A－As)
E/%=———————× 100
A0
式中：E为清除率；A0为标准管吸光度；A为样品组吸光度；As为本底管吸光度。
２结果与分析2.1提取时间对岩藻多糖提取率的影响
图１ 提取时间对提取率的影响Fig.1 Effect of extraction time on fucoidan yield
4.03.53.02.52.01.5
提取率/%
时间/h234567由图1(提取条件为料液比1:50、温度80℃时)可以看
