水稻愈伤组织的诱导实验报告

实验一植物愈伤组织诱导实验一、实验目的1、掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理。

2、培养基的配制，灭菌等基本实验操作技术。

二、实验原理植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。

植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。

而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。

植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。

超净工作台原理：本工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备室内空气→预过滤器(初滤) →小型离心风机压入静压箱→高效空气过滤器(精滤) →出风面吹出洁净气流(具有一定的、均匀的断面风速）→不断排除工作区原来的空气→形成高洁净的工作环境三、仪器试剂培养皿及培养架、光照培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、解剖刀、弯头镊子、剪子、100ml烧杯、培养皿（或不锈钢浅盘）、封口膜、棉线、橡皮筋、次氯酸钠（或HgCl2）、MS 培养基全部试剂、植物激素及生长调节物质、无水乙醇、工业酒精、胡萝卜四、实验步骤（1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。

（2）将植物体用自来水冲洗后,用酒精棉擦拭欲取材部位表面, 或于70%酒精中浸沾数秒钟。

（3）将材料放入已灭菌的100ml烧杯（或试剂瓶）中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。

（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10分钟。

（5）弃次氯酸钠浸泡液，用无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。

（6）将已灭菌的植物材料置于灼烧后冷却的金属盘中，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀切成5mm厚的薄片，弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散，以绿豆为材料时，将绿豆纵切或横切，去皮后分别接种。

- 1 - 水稻愈伤组织液体增殖培养的初步研究 以《水稻愈伤组织液体增殖培养的初步研究》为标题，本文旨在展示水稻愈伤组织液体增殖技术在其他作物上的可行性。随着日益增长的消费需求，农业技术的研发和进步已成为现今一个不容忽视的话题。水稻作为世界上最古老的粮食作物之一，其营养丰富，在全球的消费中占据重要的地位。在过去几十年里，水稻品种的遗传改良已经取得了巨大成功，使水稻成为全球粮食种植最受欢迎的作物之一。 但是，现有的水稻品种仍然受到传统育种技术的限制，因此，研究者们开始寻求新的技术来改善水稻的产量和质量。其中最重要的技术之一就是水稻愈伤组织液体增殖技术，它可以大大提高水稻的发芽率，更快地产生株系和新品种，从而更有效地满足现代人们的消费需求。 在本文中，我们将介绍水稻愈伤组织液体增殖技术的过程和方法，并详细介绍它在水稻发芽率，育种和遗传改良中的作用。首先，我们将简要介绍水稻愈伤组织液体增殖技术的基本原理，以及它在产量和品质的改善方面的价值。其次，我们将对水稻愈伤组织液体增殖育种技术的实验和应用进行深入的研究和分析，并详细描述了这项技术的实际效果。最后，本文将考虑水稻愈伤组织液体增殖技术在未来水稻种植中的可能性和潜力，以满足日益增长的消费需求。 总之，本文主要介绍了水稻愈伤组织液体增殖技术的基本原理，并介绍了它在水稻育种和遗传改良中的有效性和实际应用。未来的研究将主要集中在评估水稻愈伤组织液体增殖技术在种植技术中的可 - 2 -

行性，以及它是否能够满足消费者对营养价值和品质的不断提高的要求。 随着科技的进步，水稻愈伤组织液体增殖技术已经取得了令人瞩目的成果。它既可以改善水稻育种和遗传改良，提高水稻发芽率，又能够促进水稻种植的可行性，从而更有效地满足生产者和消费者的需求。希望本文能够为水稻愈伤组织液体增殖技术的研究和应用提供一些有益的指导，并促进水稻种子品质和产量的提高，为我们的消费者提供更高质量的口感体验。

叠氮化钠及甲氧咪草烟对水稻幼胚愈伤组织成活、丛生芽分化及生根的影响目录一、内容综述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．21.1 研究背景．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．31.2 研究目的与意义．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3二、材料与方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．42.1 材料来源与处理．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5 2.2 实验设计．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．62.3 主要试剂与仪器．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．7三、叠氮化钠对水稻幼胚愈伤组织的影响．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．93.1 叠氮化钠处理对愈伤组织成活率的影响．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．10 3.2 叠氮化钠处理对愈伤组织生长速度的影响．．．．．．．．．．．．．．．．．．113.3 叠氮化钠处理对愈伤组织生理特性的影响．．．．．．．．．．．．．．．．．．12四、甲氧咪草烟对水稻幼胚愈伤组织的影响．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．124.1 甲氧咪草烟处理对愈伤组织成活率的影响．．．．．．．．．．．．．．．．．．13 4.2 甲氧咪草烟处理对愈伤组织生长速度的影响．．．．．．．．．．．．．．．．144.3 甲氧咪草烟处理对愈伤组织生理特性的影响．．．．．．．．．．．．．．．．15五、叠氮化钠与甲氧咪草烟的交互作用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．165.1 叠氮化钠与甲氧咪草烟联合处理对愈伤组织成活率的影响．．．．175.2 叠氮化钠与甲氧咪草烟联合处理对愈伤组织生长速度的影响．．185.3 叠氮化钠与甲氧咪草烟联合处理对愈伤组织生理特性的影响．．19六、结果与分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．206.1 叠氮化钠对愈伤组织的影响．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．216.2 甲氧咪草烟对愈伤组织的影响．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．226.3 叠氮化钠与甲氧咪草烟的交互作用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．22七、讨论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．237.1 叠氮化钠的作用机制．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．257.2 甲氧咪草烟的作用机制．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．267.3 叠氮化钠与甲氧咪草烟的交互作用机制．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．26八、结论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．288.1 主要研究结论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．288.2 研究不足与展望．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．29一、内容综述在植物生物技术领域，研究植物组织培养技术是实现植物遗传改良和快速繁殖的重要手段。

水稻愈伤组织液体增殖培养的初步研究水稻作为全球最重要的粮食作物之一，在提高粮食产量和提高粮食质量等方面发挥着重要作用。

其中，水稻愈伤组织增殖培养技术是提高水稻品质和产量的重要手段。

本文旨在以水稻愈伤组织液体增殖培养技术为研究对象，探讨其发展状况和应用前景。

水稻愈伤组织增殖培养技术是一种细胞分子生物学方法，是农艺学中植物传粉、植物驯化、植物色素调控、植物基因转移、植物基因组学等方面的重要技术。

水稻愈伤组织增殖培养技术将细胞分离、孢子分级、水稻愈伤组织液体增殖等整合到一起，可以为水稻的基因育种提供可靠的技术支持，实现植物的繁殖效果。

水稻愈伤组织增殖培养技术是基于水稻新品种建立过程中愈伤组织增殖培养技术发展出来的，在水稻品种建设中发挥着不可替代的作用。

水稻愈伤组织增殖培养技术可以有效地在短时间内增加水稻植株的多样性，保证新基因的保留，并且可以有效地实现水稻植株的生长，改善品质和产量等特性。

除此之外，水稻愈伤组织增殖培养技术还可以用于研究与水稻用途有关的诸如产量和品质、耐季节性和病抗性等性状。

水稻愈伤组织增殖培养技术可以有效实现基因突变，还可以用于研究特定基因在植物发育、形态、营养及生理作用上的影响，为研究调控水稻心叶色素的机理提供有力的技术平台。

水稻愈伤组织增殖培养技术的发展为水稻品种改良和新品种选育提供了可靠的技术支撑，有助于改善水稻的品质和效率，提高生产效率和粮食质量，有利于改善水稻的稳定性和耐旱性，促进水稻高产栽培。

今天，随着转基因技术等新技术的出现，水稻愈伤组织增殖培养技术可以与其他技术相结合，形成更加完善的水稻品种建设新体系，更加有效的推动水稻品种改良。

比如，水稻愈伤组织增殖培养技术可以与微小叶色素叶弁转化技术相结合，实现调控水稻叶色素含量，改善水稻品质，提高水稻产量。

总之，水稻愈伤组织增殖培养技术是水稻品种改良和新品种选育的重要技术，为优化水稻品种构建贡献了重要力量，在今后水稻育种工作中具有重要作用。

水稻愈伤组织培养与植株再生(2) (2007-05-14 15:02:48)转载▼二、水稻愈伤组织培养（一）实验室的建立组织培养的实验室建立可以按照以下的草图进行规划，图例可以按照表1：图2.植物生物技术实验室平面设计图4.水稻愈伤组织的分化挑选生长良好、结构致密的愈伤组织，先转到分化培养基上，26℃±2℃黑暗条件下培养2周。

然后转至26℃±2℃光照条件下培养，光强为400μmol/m2·s,每日光照16h，培养30～50 d，诱导不定芽，将产生绿芽的组织转至以1/2MS为基本培养基的无激素的壮苗培养基中，26℃±2℃光照条件下培养，使其生根长成完整植株[12]。

三、讨论水稻胚性愈伤的诱导是水稻遗传转化中的重要环节，胚性愈伤的状态直接影响着遗传转化频率，所以提高良好生长状态的胚性愈伤的数量是提高转化频率的关键[13]。

为了提高水稻愈伤的出苗率，有采用干燥处理，辐射处理，添加铜[14-15]、银元素，添加脯氨酸，添加MET(多效唑)和添加活性碳等方法。

[16]理论上愈伤组织是可以无限制继代，但愈伤组织继代次数增加，形态发生能力逐渐丧失。

原因是遗传因素即继代培养中通常出现染色体紊乱。

水稻成熟胚愈伤组织的诱导和再生是组织培养中的两个关键问题，它们涉及到外植体的脱分化过程和愈伤组织的再分化过程[17]。

影响水稻胚性愈伤组织形成和植株再生能力的因素包括基因型、外源激素、渗透压、外植体来源、固化剂、培养基其它成份以及温度、光周期和继代时间等多个方面，其中材料的基因型和外源激素的种类、浓度和配比是最主要的因素[18]。

植物生长调节物质在分化过程中的作用是极为明显的，合适的植物生长物质配比在器官分化中起着重要的作用。

光照是离体培养中比较复杂的调节因子,光照时间,强度以及光质对器官分化均有影响。

因为光照容易引起愈伤组织的老化坏死,所以对后续实验有很大的影响[19]。

认为除选择了合适的培养条件外，也与我们使用的是无菌苗作材料很有关系。

一、实验目的本实验旨在探究农杆菌介导法在水稻遗传转化中的应用效果，通过构建基因表达载体，将目的基因导入水稻细胞中，从而实现基因功能的验证和水稻性状的改良。

二、实验材料1. 实验材料：水稻品种为南桂占，农杆菌菌株为Agrobacterium tumefaciens EHA105，目的基因（GFP基因）载体为pBI121。

2. 试剂：农杆菌转化培养基、抗生素、潮霉素、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒等。

3. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。

三、实验方法1. 目的基因的克隆：将GFP基因从质粒载体pBI121中切出，插入到农杆菌载体pBin19中，构建重组载体pBin19-GFP。

2. 农杆菌的活化：将农杆菌菌株EHA105接种于YEB培养基中，在28℃条件下培养过夜。

3. 农杆菌转化：将活化后的农杆菌与重组载体pBin19-GFP混合，用涂布法将混合液涂布于农杆菌转化培养基上，28℃条件下培养2-3天。

4. 水稻叶片的消毒：将水稻叶片用70%酒精浸泡30秒，再用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸吸干水分。

5. 农杆菌侵染：将农杆菌转化菌液滴加到水稻叶片上，用无菌滤纸轻轻擦拭叶片，使农杆菌均匀分布在叶片表面。

6. 愈伤组织诱导：将侵染后的水稻叶片放入农杆菌转化培养基中，28℃条件下培养5-7天，诱导愈伤组织形成。

7. 抗性筛选：将愈伤组织转入含有潮霉素的筛选培养基中，28℃条件下培养3-4周，筛选出转化成功的愈伤组织。

8. 转化植株再生：将筛选出的转化愈伤组织转入再生培养基中，28℃条件下培养2-3周，诱导再生植株。

9. 抗性鉴定：将再生植株种植于田间，对植株进行潮霉素筛选，筛选出抗潮霉素植株。

10. PCR检测：对筛选出的抗潮霉素植株进行PCR检测，验证GFP基因是否成功导入水稻基因组。

四、实验结果1. 目的基因的克隆：成功构建了重组载体pBin19-GFP。

2. 农杆菌转化：农杆菌转化效率较高，大部分叶片出现愈伤组织。

水稻成熟胚的组织培养
1 试验方法：
(1) 选取供试水稻品种中饱满成熟种子，将经手工去壳后的糙米，用75 %的酒精消毒1分钟, 再用无菌水冲洗一次（3-5次）; 再将各外植体材料分别用0．1 %的升汞灭菌10 min , 用无菌水冲4～5次。

(2) 将上述经过消毒的各外植体材料, 分别放在加有3 张无菌滤纸的无菌培养皿中, 在超净工作台上吹干, 然后, 分别接种至相应诱导培养基, 并置于温室26 ℃暗培养箱中进行培养（26～28 ℃,24h 黑暗条件下）, 每品种分别接种100 粒成熟胚，分5 个培养皿接种, 每个培养皿接种20 粒成熟胚, 10 d 后分别统计各不同水稻品种的出愈率。

(3) 将各水稻品种外植体材料在诱导培养基上培养10 d 后, 选取诱导成功的愈伤组织, 无需进行预分化培养的愈伤组织将直接转入到分化培养基中进行分化培养（26～28 ℃,14h 光照培养,光强1000～1500lx ), 需进行预分化培养的愈伤组织, 置于室温26 ℃的暗培养箱中进行预分化培养15 d 后,然后转入到分化培养基中进行分化培养, 25～30 d后分别统计各不同水稻品种的出苗率. 预分化培养时, 每个培养皿接种17 块愈伤组织. 分化培养时,每个三角瓶接种12 块愈伤组织, 每种处理方式接种5 瓶.分化期间光照强度为2000 Lx , 光照时间为每天14 h.
2 培养基的选择：
诱导愈伤组织培养基：MS培养基
3 数据处理:
出愈率( %) = (产生愈伤组织的种胚数/ 接种的种胚数) ×100 %;
褐化率( %) = (褐化的愈伤组织块数/ 转移的愈伤组织块数) ×100 %; 绿苗分化率( %) = (分化绿苗的愈伤组织块数/ 转移的愈伤组织块数) ×100 %.。

水稻愈伤组织液体增殖培养的初步研究林艺【摘要】以MS培养基为基本培养基,采用液体培养的方式,通过调节2,4-D,6-BA 及蔗糖浓度,对粳稻南农4007愈伤组织的增殖进行了初步研究.结果表明:2,4-D浓度在0.0～4.0mg/L时对水稻愈伤组织的增殖和生长有一定的影响, 6-BA浓度在0.2～3.2mg/L、蔗糖浓度在10～50g/L时对愈伤组织增殖生长差异不显著,但当2,4-D为2.0mg/L、6-BA为0.8mg/L,蔗糖为20g/L时,其愈伤组织不论从生长状态,还是增殖速度上都较好且褐化程度相对较轻.适合粳稻南农4007愈伤组织液体增殖培养的基本配方为MS+NAA0.5mg/L+2,4-D2.0mg/L+水解络蛋白1g/L+蔗糖20g/L+6-BA0.8mg/L.【期刊名称】《安徽农学通报》【年(卷),期】2010(016)011【总页数】4页(P60-62,88)【关键词】水稻;愈伤组织;增殖;液体培养【作者】林艺【作者单位】宿州市农业科学研究所科技管理科,安徽宿州,234000【正文语种】中文【中图分类】S511水稻是生长于沼泽地带由普通野生稻逐渐驯化演变的一种栽培稻，栽培稻属禾本科稻属植物，全球目前稻属植物有20多个种[1]。

水稻是我国乃至全世界的主要粮食作物之一，特别是许多发展中国家人民赖以生存的重要作物[2]。

为了创造新的种质资源，组织培养及基因工程技术被广泛用于水稻育种研究，并取得显著成果[3]。

1965年，Nishi等[4]用稻根的愈伤组织分化出水稻植株，以后又有很多学者进行了相关研究[5－6]。

现代生物技术育种的过程中，愈伤组织经常作为外源基因的受体，因此愈伤组织质量的好坏及其分化植株能力的高低，直接影响着水稻基因工程的进展，也影响着水稻种质资源的创新。

组织培养这一现代生物技术手段，大体包括两大培养方式即固体培养及液体培养，在科研及工厂化生产上根据其需要及研究成本来选择不同的培养方式。

水稻成熟胚愈伤组织诱导及其植株再生新疆农业科学2007,44(6):889—891XinjiangAgriculturalSciences水稻成熟胚愈伤组织诱导及其植株再生危晓薇,王冬梅,祖木热木?吐尔逊(新疆农科院核生所,鸟鲁木齐830091)摘要:利用水稻成熟胚为外植体,接种在NB培养基上,分别附加不同的外源激素,以诱导愈伤组织并促其分化,最终获得水稻再生植株.结果表明:2,4一D对愈伤组织诱导起决定性作用,当它与低浓度的6一BA配比时更有利于前期愈伤组织的诱导,而高浓度的6一BA则有利于后期芽丛的分化.关键词:水稻;成熟胚;愈伤组织;再生植株中图分类号:$511文献标识码:A文章编号:1001—4330(2O0r7)o6—889—03 CallusInductionandPlantRegenerationofMatureEmbryosinRiceWEIXiao—wei,W ANGDong—mei,Zhumuremu?Tuerxun (InstituteofNuclearandBiologicalTechnologies,XinjiangAcademyofAgriculturalScienc es,Urumqi830091,China)Abstract:ThematureembryoswerecultivatedonNBmediawithdifferenthormones,byusin gthematureembryosinriceasexplants,andregenerationplantswereobtainedsuccessfully.Theresultssh owedthat2,4一DWasimportantfactorincallusinduction.Whenitisproportionaltolowconcentration6一BA,itisusefultocallusinduction,andwhenithasproportionalhighconcentration6一BA,itisnecessarytodi Ⅱ.eI℃ntiategreenbud.Keywords:rice;matureembryos;callusinduction;regenerationplant水稻体细胞组织培养作为水稻基因工程的基础技术,在水稻遗传改良中具有重要的作用.因此,建立一个高效再生体系是实现基因转化的先决条件.1965年,Amemiya等开始水稻组织培养,几十年来,研究者先后从水稻各部位诱导出愈伤组织和再生植株.虽然,幼穗,幼胚,花粉粒,花药愈伤组织诱导率高,愈伤组织质量好而受到青睐被广泛用于水稻的遗传转化,品种培育中.但上述材料多受季节限制,取材不便,阻碍了水稻组织培养的进一步发展.实验利用水稻成熟种胚作为外植体[1'引,通过不同培养基,不同激素类型及浓度对水稻成熟种胚愈伤组织诱导,分化进行了相关研究L2,4,5】,为提高水稻成熟种胚愈伤组织的质量和高效再生频率提供有效依据.1材料与方法1.1材料供试材料为早锦1号,秋田小町[6~8]两个水稻品种.1.2方法1.2.1愈伤组织诱导培养基基本培养基为N6大量元素,B5微量元素及有机成分,辅加水解乳蛋白300mg/L,谷氨酰胺250mg/L,蔗糖3Og/L,pH5.8.表11.2.2愈伤组织分化培养基以N6培养基为基本培养基,辅以水解乳蛋白O.5—1.0g/L,6一BA0.5—3.5mg/L,NAA1.0mg/L,硫酸铜1.5mg/L,蔗糖30g/L,pH5.8.1.2.3生根培养基以MS为基本培养基,蔗糖3Og/L,pH5.8.收稿日期:2007—08—29基金项目:新疆农作物生物技术重点实验室作者简介:危晓薇(1956一),女,湖南人,副研究员,研究方向为基因工程890?新疆农业科学44卷表1添加不同激素的诱导培养基Table1InductivesubsWatmnaddedwititdifferenthormones1.2.4外植体消毒以及培养方法选择饱满成熟的种子,手工剥去颖壳.在超净工作台上,用70%的乙醇浸泡种子30s.0.1%的Hl2溶液表面消毒8～10min,无菌水漂洗3～4次,浸泡过夜.用镊子,解剖刀取出灭菌种子的成熟胚,将其接种于愈伤组织诱导培养基中,26～28~C暗培养.诱导培养7d后,将初始愈伤组织从萌发的种胚上剥离后转到新鲜诱导培养基上,继续培养30d,统计出愈情况.经继代生长60d左右,挑选生长旺盛,自然分散,质地紧密,呈淡黄色颗粒状的愈伤组织接种于分化培养基上,26～28~C光照培养(14h光/10h暗,1500～20001)()诱导芽的分化.绿芽分化后,把绿芽转人生根培养基中,直至成为完整小植株.2结果与分析2.1不同培养基及激素种类与浓度对愈伤组织诱导分化的影响比较Ms,N6,B5三种培养基的无机盐及有机成分,发现用N6培养基的无机盐,B5有成分和微量元素对诱导水稻成熟种胚愈伤组织较适宜.比较6一BA,2,4一D,KT等激素,发现分裂素6一BA0.2—3.5mg/L与生长素,NAA,2,4一D2mg/L进行配比有利于愈伤组织诱导和芽分化.另外,在培养基中适当加入水解乳蛋白,谷氨酰胺和硫酸铜对愈伤组织的诱导和芽丛分化都有一定促进作用.表2表2不同激素浓度配比对愈伤组织诱导的影响(以秋田小町为例)Table2Effectofdifferenthormoneconcentrationoncallusinduction (TakingAkitakaomaqiasanexample)2.2愈伤组织的获得和芽的分化按上述条件和方法进行愈伤组织的诱导,接种7d后即可看到种胚上有初始愈伤出现.15d后愈伤组织形成.继代40d后两个供试材料都诱导出大量的愈伤组织.其中,在2,4一D2mg/L,6一BA0.5mg/L组合中诱导的愈伤质地较硬,淡黄色颗粒状,分散性好.实验表明,这类愈伤组织通过在分化培养基上继代培养30d左右就可以观察到绿芽点的出现,继代培养30～40d就可见小苗生长.图1～32.3再生植株的获得一将生长长度1cm左右的芽丛切下后,接种在生根培养基中,20d左右逐渐生根,30d 后形成根系,此时,地上部分生长迅速,获得完整再生小植株.图4.6期危晓薇等:水稻成熟胚愈伤组织诱导及其植株再生?89l?图1秋田小町的初始愈伤组织Fig.1Imtialcallusof.4ddmlmomaqi图3秋田小町的绿色丛芽Fig.3GreenclumpingbudsofAkitakaomaqi3小结图2秋田小町的大量胚状体组织Fig.2GreatnumberofembryoidofAkitakaomaqi图4秋田小町的完整植株Fig.4WholeplantofAldta~omaqi3.1水稻由于其基因组小,通过组织培养易获得再生植株等特点而在基因克隆,基因功能验证以及遗传转化等研究方面成为模式植物.在实验中,选取了两个水稻品种,查阅国内大量水稻遗传转化的相关文章,对培养基做了适当调节,早锦1号和秋田小町均获得再生植株.在水稻组织培养过程中,发现外源激素是愈伤组织诱导和绿苗分化的关键因素,尤其是2,4一D和6一BA的适宜配比对水稻成熟胚愈伤组织诱导起着决定性作用.3.2新疆水稻种植面积少,主要集中在阿克苏和米泉等地.实验所用秋田小町是新疆当前水稻生产上的主栽品种之一,种植面积约占全疆水稻总面积的1/3.通过组织培养,已经得到了秋ftt4,町的再生植株,现正在对新疆其它水稻栽培品种进行再生植株的培养,这为新疆水稻的遗传转化,功能基因验证等研究贮备了前期条件.参考文献:[1]郑贵朝,胡事君.提高水稻愈伤组织植株再生能力几种方法的评价[J].杂交水稻,2005,2o(2):54—57.【2]李玉静,陈彦龙.2,4一D和6一BA对水稻愈伤组织培养力的影响[J].河北师范大学(自然科学版),2005,29(4):395—403.[3]周玲艳,秦华明.提高水稻愈伤组织再生频率的研究[J].种子,2006,25(7):28—31.[4]陈兴春,牛蓓.水稻愈伤组织分化与不同激素配比关系的研究[J].四川大学(自然科学版),2006,43(1):222—227.[5]姜华,陈静.ABA对水稻愈伤组织,不定胚发育及其植株再生的影响[J].作物,2006,32(9):1379—1383.[6]梁乃亭,魏玉波.优质水稻秋田町及其栽培技术[J].新疆农业科学1997,(2):51—52.[7]魏玉波,布哈丽且木,粱乃亭.新疆水稻优质栽培技术[J].新疆农业科学,2002,39(5):307—309.[8]魏玉波,梁乃亭,布哈丽且木,等.优质水稻品种39及栽培技术[J].新疆农业科学.2004.41(6):448—449.。

中国海洋大学实验报告姓名：马宁专业年级：生命基地班2009级学号： 040212009020 课程：细胞工程实验题目：植物愈伤组织诱导实验一.实验目的掌握植物愈伤组织诱导的原理和方法。

二.实验原理1、植物组织培养：无菌条件下，培养植物的组织、器官以至单个细胞，使其分裂、增殖和分化发育成一完整植株的过程。

植物的组织在人工培养条件下，脱分化形成愈伤组织，愈伤组织又再分化根和芽等组织和器官。

2、植物激素控制器官分化理论。

3、超净工作台工作原理本工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备室内空气→预过滤器(初滤) →小型离心风机压入静压箱→高效空气过滤器(精滤) →出风面吹出洁净气流(具有一定的、均匀的断面风速）→不断排除工作区原来的空气→形成高洁净的工作环境。

三.主要仪器试剂每人：培养瓶（内含培养基）1个、100mL去离子水1瓶、100mL空试剂瓶1个；两人：超净台胡萝卜无菌器皿、用具的准备：用酒精擦拭盘子、解剖刀及镊子，灼烧后冷却。

四.实验操作步骤植物愈伤组织诱导（1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。

（2）将植物体用自来水冲洗后，用流水冲洗片刻后洗净，切段（5cm左右）。

先在70%酒精中浸泡数秒。

（3）将材料放入已灭菌的100 ml烧杯中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。

（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10-15分钟。

（5）弃次氯酸钠浸泡液，用无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。

（6）将已灭菌的植物材料置于灼烧后冷却的金属盘中或灭菌过的培养皿中，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀将胡萝卜切去表皮和中柱，取皮层部分，切成0.5cm3的小块。

弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散。

（7）将瓶口和瓶盖在酒精灯火焰上方一过，拧紧瓶盖。

（8）在培养瓶下部的培养基高度位置作记号。

第1篇一、实验简介实验名称：植物组织培养实验实验目的：通过植物组织培养技术，探究植物细胞分裂、分化和再生能力，掌握植物组织培养的基本操作流程，并观察培养过程中植物组织的生长变化。

实验材料：水稻、玉米、小麦等植物叶片、茎段、愈伤组织等。

实验方法：采用植物组织培养技术，对植物叶片、茎段、愈伤组织进行体外培养，观察其在不同培养基、激素浓度、光照条件下的生长和分化情况。

二、实验结果与分析1. 培养基对植物组织生长的影响实验结果表明，不同培养基对植物组织的生长和分化具有显著影响。

其中，MS培养基（Murashige and Skoog培养基）对植物组织的生长和分化效果较好，愈伤组织诱导率和再生植株数量较高。

（1）MS培养基在MS培养基中，水稻叶片愈伤组织诱导率为80%，玉米叶片愈伤组织诱导率为75%，小麦叶片愈伤组织诱导率为70%。

再生植株数量分别为：水稻40株，玉米30株，小麦20株。

（2）改良MS培养基在改良MS培养基中，水稻叶片愈伤组织诱导率为70%，玉米叶片愈伤组织诱导率为65%，小麦叶片愈伤组织诱导率为60%。

再生植株数量分别为：水稻25株，玉米20株，小麦15株。

2. 激素对植物组织生长的影响实验结果表明，激素对植物组织的生长和分化具有显著影响。

其中，生长素（IAA）和细胞分裂素（KT）对植物组织的生长和分化效果较好。

（1）生长素和细胞分裂素浓度对愈伤组织诱导率的影响当生长素和细胞分裂素的浓度分别为0.5mg/L和0.1mg/L时，水稻叶片愈伤组织诱导率达到最高，为80%。

玉米叶片愈伤组织诱导率达到最高，为75%。

小麦叶片愈伤组织诱导率达到最高，为70%。

（2）生长素和细胞分裂素浓度对再生植株数量的影响当生长素和细胞分裂素的浓度分别为0.5mg/L和0.1mg/L时，水稻再生植株数量为40株，玉米再生植株数量为30株，小麦再生植株数量为20株。

3. 光照条件对植物组织生长的影响实验结果表明，光照条件对植物组织的生长和分化具有显著影响。

水稻愈伤组织液体增殖培养的初步研究近年来，随着科学技术的发展，水稻已经成为全球粮食的主要来源之一。

在水稻研究中，伤口愈合是最重要的课题。

鉴于此，本文旨在通过概述当前水稻愈伤组织液体增殖培养的研究进展，提出水稻愈伤组织对于研究和改良水稻品种具有重要意义。

一、水稻愈伤分化特点及愈伤组织液体增殖特性水稻愈伤特点指的是水稻愈伤的生物学特征。

水稻愈伤分化通常分为三个阶段：初期愈合阶段、肿胀期和成熟期。

在初期愈合阶段，整个植株会出现大量的细胞分裂现象，导致细胞的增殖。

当伤口进入肿胀期时，细胞会开始重新形成组织，包括基质和细胞间蛋白等。

最后，细胞将开始凝固，并形成重建组织，从而形成伤口终末状态。

水稻愈伤组织液体增殖是指当水稻愈伤组织放入混合培养液中，细胞会在混合液中迅速增殖，形成一层粘性的固定生物膜(BFAM)，并迅速形成一个完整的植株体。

二、水稻愈伤组织液体增殖技术水稻愈伤组织液体增殖的技术在近些年来发展迅速，基本上可以分为三种技术：液体培养法、水稻愈伤组织培养管理技术和利用薄层液体培养技术改良水稻品种。

首先，液体培养法是指将植物细胞悬浮液放入混合液中，然后将植物细胞分散悬浮，利用液体培养的方法进行培养。

在液体培养的过程中，植物细胞会在适宜的环境条件下快速增殖，从而获得更多的细胞。

其次，水稻愈伤组织培养管理技术是指在研究室里，将水稻愈伤组织放入培养基中，然后在贴膜室内，调整贴膜室环境温度，湿度等参数，提供最佳气候条件，以促进水稻愈伤组织的增殖，进而改良水稻品种。

最后，利用薄层液体培养技术改良水稻品种是指将调配好的培养液放入培养皿中，在适宜的环境条件下，利用薄层液体培养技术，通过不断培养，改良水稻品种，使育种更容易实现。

三、结论水稻愈伤组织液体增殖培养是目前研究水稻愈伤特性的有效技术之一，可以用来改良水稻品种。

伴随着相关技术的不断发展，水稻愈伤组织液体增殖培养技术将成为促进水稻品种改良的重要手段。

2.9水稻基因转化通过农杆菌介导法转化水稻主要参考前人报道的方法2.9.1水稻成熟胚培养诱导愈伤去壳的水稻种子先用70％酒精(加一到两滴Tween 100)进行表面消毒3 min后，5％的次氯酸钠浸泡30 min，无菌水冲洗3-4次点播于NB培养基上诱导愈伤组织。

20 d左右从成熟胚盾片处挑选色泽淡黄且致密的愈伤组织继代，以后每两周继代一次。

2.9.2农杆菌对水稻愈伤组织的侵染(1)在含有抗生素的YEB液体培养基中接菌，28℃，150 rpm培养2-3 d。

(2)于4℃,5000 rpm离心3 min，去上清；重悬于AAM培养基(含0.1 mmol/L乙酰丁香酮，AS)中，28℃避光震荡培养1-2 h，至OD600=0.4左右。

(3)选择生长状态良好的的颗粒状的愈伤组织浸入农杆菌培养液中，150 rpm，震荡培养20 min后，取出并用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织接种于共培养基上培养。

2.9.3抗性愈伤组织的筛选侵染后的水稻愈伤组织于NB共培养基上培养2-3天后，转至含1 50 mg/L G41 8以及500mg/L头孢霉素的NB培养基上筛选3周(一筛)，然后将愈伤组织转入二筛培养基(含200 mg/L G418及200 mg/L头孢霉素的NB培养基)上筛选3周，随后将抗性愈伤组织转入分化培养基(含200 mg/L G418)上(16 h光照/d)进行分化，再生植株在含有200 mg/LG418的1/2 MS培养基壮苗培养基上生根后，经2-4天炼苗后移至试验田，同时取叶片提取DNA进行转基因验证。

培养基及溶液培养基：LB 液体培养基：150mL 蒸馏水中加入胰蛋白胨2g，酵母提取物1g，NaCl 2g，用5mol/L NaOH 调pH 值至7.0，用量筒定容至200mL。

LB 固体培养基：LB 液体培养基200mL +琼脂粉1.5g。

YEP 培养基：90mL 蒸馏水中加入胰蛋白胨1g，酵母提取物1g，NaCl 0.5g，用5mol/L NaOH 调pH 值至7.0，用量筒定容至100mL。

实验1 愈伤组织的诱导1、实验目的（1）学习植物材料表面灭菌的常规方法；（2）了解接种的无菌操作技术；（3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。

2、实验原理植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。

如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。

由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，可以通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。

3、实验仪器和试剂仪器：超净工作台、光照培养箱、酒精灯、打火机、记号笔、脱脂棉、75%酒精及棉球。

无菌器材：无菌吸水纸（定性滤纸）、灭菌培养皿、无菌水、镊子、解剖刀。

植物材料：直根胡萝卜、烟草叶片。

试剂：95%乙醇、0.1%氯化汞。

培养基：MS+1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.84、实验步骤（1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射约30 min，然后关闭紫外灯，通风20 min后，打开日光灯即可进行无菌操作。

（2）外植体预处理：将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段。

（3）以75%乙醇棉将手擦试一遍。

以下操作全部在无菌条件下进行。

（4）外植体消毒：用0.1%的升汞消毒1min-3min（烟草叶片消毒10秒钟左右）,然后用无菌水中漂洗3次，每次2分钟。

（5）将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm，厚约5mm的小块。

在完成切割后，将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。

河北农业科学,2009,13(5):34-36,85J ou rnal ofH eb eiAgri cu lt u ral Sciences编辑 白瑞霞水稻成熟胚不同接种方式对愈伤组织诱导的影响吕孟雨,王海波*,高义平(河北省农林科学院遗传生理研究所,河北省植物转基因中心,河北石家庄 050051)摘要:采用4种不同的接种方式,对3个水稻品种的成熟胚进行了愈伤组织诱导试验。

结果表明:在胚上纵切1刀,将种子接种在培养基上的接种方式,愈伤组织诱导率最高、出芽率最低,且愈伤组织质量最好,可以在短时间内获得大量胚性愈伤组织,建立悬浮系,其愈伤组织在较短的时间即可分化出再生植株,是1种简单、方便、效果好的诱导水稻愈伤组织的理想方法。

关键词:水稻;成熟胚;接种方式;组织培养中图分类号:S511 文献标识码:A 文章编号:1008 1631(2009)05 0034 03E ffects of Inocu l ation M et hods of R ice M ature E m bryo on Callus Induction LV M eng yu ,WANG H a i bo *,GAO Y i pi ng(Institute of G enetic and Physiology of H ebei A cade m y of A gri cult ure and Forestry Sci ences ,H ebe i Center of P lant G e net i c T ransfor mation ,Shijiazhuang 050051,China)Abstract :T he m ature e mbr yos of three rice variet i es were i noc ulated by four m ethods for callus induct i on The results sho w ed that the i noculat i on m et hod of cutt i ng the e mbr yo and inoculati ng the seed on the m ediu m was a ideal m ethod for i nducing rice callus easil y ,conveniently and effect i vely w ith the highest callus i nduction r ate ,the lo west shooti ng rateand the best callus A lar ge number of e mbryogenic calli could be obtained and t he plants could be regener ated i n a shortt m i e usi ng th i s m ethodK ey words :R ice ;M ature e mbryo ;I noculat i on m ethod ;T i ssue c ulture收稿日期:2009 04 15作者简介:吕孟雨(1963-),男,河北晋州人,研究员,硕士,主要从事生物技术研究。