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纳豆激酶高产菌株的筛选鉴定及特性研究

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中 图分 类 号 ：Ｑ ４ ． ９６５ 文 献标 志 码 ：Ａ
Ｓ ｕ ｙｏ ｃ ｅ ｎｎ ｔ ｄ ｎ Ｓ ｒｅ ｉ ｇ， Ｉ ｅ ｔ ｃ ｔ ｎ ａ ｄ Ｃ ａａ ｔ ｒ ｔ ｓｏ ｔ ｉ ｉ ． ｄ ｎ ｉ ａｉ ｎ ｈ ｒ ｃ ｅｉｉ ｆＳ ｒ ｎ ｗ ｔ Ｈｉ ｈ ｉ ｆ ｏ ｓｃ ａ ｈ ｓ
文章编号 ：１７ — ６ ６（ ０ ７） ５ ０ ０ － ４ ６ １ ９ ４ ２０ ０ －０ ４ ０
纳豆激 酶高产 菌株 的筛选鉴定及特性研 究
满丽莉 ，张丽萍
（ 黑龙江八 一农 垦大学 ，黑龙江 大庆 １ ３ ） ６ ３ ９ １
摘 要 ：从 ５ 种不 同样 品中分离 得到 ３ 菌株 ，通 过初 筛和复筛 ，筛选 出 １ ０株 株纳豆激 酶高产菌株 Ｔ ３ － ，其产酶活性 可
Ｎａｔ ｋｎ ｓ ｖｔ ｔ ｉａ ｅＡｃ ｉ ｏ ｙ
Ｍａｌ ／ｉ ｌ Ｉ ｌ， Ｉｐｎａ ｄＲ ｃ ｍ ｔ ｎＵ ｉ ｒｔ，Ｄ ｑｎ ，Ｈ ｉ ｎｊｎ ６ ３ ９ ｈｎ） Ｈｅｏｇｉ ｇＡ ｇｓ Ｆｒ ｎ ｅｌ ａｉ ｎｖｓ ｙ ｌ ａ ｓＬ ａ ｏ ｅｉ ａｉｇ ｅ ｏｇ ａｇ１３ ，Ｃ ｉ ｌ ｉ １ ａ
维普资讯
第 ５期（ 总第 １０期） ０ ２０ ０ ７年 ５月
农产品加工 ‘ 刊 学
Ａｃｄ ｍｉ Ｐｒ ｄｃｌ ｆ ａｍ Ｐｏ ｕｔ Ｐｏｅｓ ｇ ａｅ ｃ ｅｉ ｉ ｒ ｒ ｃ ｒｃｓｉ ｏ ａｏＦ ｄ ｓ ｎ
Ｎｏ５ ． Ｍａ ． ｙ
达 到 ３１８ ７Ｉ ， Ｌ ５ ． ｍ ，并对菌株 的个体形态 、菌落形态 和生理生化特征进行 了鉴定 ，确认菌株 Ｔ ３ 于枯草芽孢杆菌 ９ ｕ －属
属 。该 菌株对温度 、ｐ Ｈ值 和胆盐具有较好 的耐受性 ，并且具有 良好的传代稳 定性。 关键词 ：纳豆激酶 ；菌株 ；筛选 ；特性
Ｎ Ｃ 为 ０ ％，ｐ ａＩ ． ５ Ｈ值为 ７ ～ ．，在 温度 １１ｏ下灭 ．７ ２ ４ ２ Ｃ 菌 ２ ｉ。 ０ｍ ｎ １ 力祛 ． ２ １ ． 菌种 的分 离与初 筛 ．１ ２ 取 ３ ４粒 纳 豆样 品放 入 灭 菌 试 管 中 ，加 入 ５ｍ ～ Ｌ 灭 菌 生 理 盐 水 洗 涤 后 ，分 装 于 离 心 管 中 ， 以 转 速 １ 材料 与方 法 ５００ｒ ｉ 心 ５ｍｉ ，将 上 清液 倒掉 ，用 无 菌生 ０ ｒ ｎ离 ／ ａ ｎ后 １ 材料 ． １ 理 盐 水将 菌 体 悬 起 ，在 温 度 ８ ５℃水 浴 ５ｍｎ以 杀死 ｉ １ ． 供 试 样 品 ．１ １ 大部 分 的营养 体 及 杂菌 。将 菌 液进 行 １ 的梯 度 稀 ０倍 ％ ．％，０ １ ，分 别 吸 ．％ ０ 供 分离 的样 品分 别 来 源 于 日本 的旭松 有 机 纳 豆 、 释 ，选 取其 质 量 分 数 为 １ ，０１ 镰 食 山纳 豆 ， 中国的永 川 豆豉 、太 和豆 豉及 其 自然发 取 ０５ｍＬ菌 液 涂 布 ４ ． ％的 酪 蛋 白 高盐 平 板 ，在 温 度 酵 的纳 豆 。 ３ ７℃下培 养 ２ ～ ６ｈ 目测透 明 圈大小 ，在每个 培 养 ４ ３ ，
Ａ 阿 ： Ｓ ｒｅ ｉｇ ３ ｔａｎ ｒｍ ｖ ｉｅｅ ｔｓ ｐｅ ， ｗｅ ｇｉｅ ｔａｎ Ｔ ３ ｈ ｓ ａ ｏ ｉａｅ ａ ｔ ｉ ｏ ｌ ｒａ ｈ ｂ吐 ｃｅ ｎｎ ０ ｓ ｉ ｓｆｏ ｆ ｅ ｄｆ ｒｎ ａ ｌｓ ｒ ｉ ｍ ａｎ ｄ ｓ ｉ － ｗ ｏ ｅ ｎ ｕ ｋｎ ｃ ｖｔ ｃ ｕｄ ｅ ｃ ｒ ｓ ｉ ｙ
ｃ ａ ａ ｔ ｒ ｔ ｓ ｔ ｅ ｂ ｃＨ ｓｓ ｂ ｌ ｓ ｓ ｉ ｓ ｉ ｅ ｔ ｅ ． ｔ ｎ Ｔ ３ ｈ ｏ ｄ ｔｌｒ ｃ ｏ ｔｍｐ ｒ ｔ ｒ ， ｐ ， ｇ ｌ ｌｄ ｅ ａｔ ｈ ｒ ｃｅ ｉ ｉ ， ｈ ａ ｉ ｕ ｕ ｉｔ ｔ ｎ ｗａ ｎｉ ｄ Ｓ ａ － ａ ｇ ｏ ｏｅ ａ ｅ ｔ ｓｃ ｉ ａ ｄ ｉ ｆ ｒ ｉ ｓ ｎ ｅ ｅ ａｕ ｅ Ｈ ａｌ ａ ｄ ｒｓ ， ｂ ｌ ｎ ｏ ｄ ｇ ｎ ｒｔ ｔ ｌ ｙ ａ ｄ ｇ ｏ ｅ ｅａ ｉｎ ｓ ｂｉｔ ． ｏ ａ ｉ
Ｋｅ ｙ
： ｎ ｔ ｋ ｎ ｅ ｓ ａ ｎ ｓ ｒｅ ｉｇ；ｃ ａ ａ ｔｒｓｉｓ ａｔ ｉ ａ ； ｔ ｉ ； ｃ ｅ ｎ ｎ ｏ ｓ ｒ ｈ ｒ ｃ ｅｉｔ ｃ
０ 引 言
１１ ．． 培养基 ２
酪 蛋 白高盐 平板 ：酪 蛋 白为 １ ％，酵母 提 取 物 为
血栓性 疾病 是一 类 严重 危害 人类 健康 和生 命 的常 ０５ ，Ｎ Ｃ 为 ４ ， 琼 脂 为 １ ％～ ％ ， ｐ 值 为 ．％ ａＩ ％ ． ２ ８ Ｈ 见 病 与 多发 病ｆ ｌ Ｊ 统 计 ，全 世 界 每 年 患血 栓 栓 塞 性 ７２ ７ ，在 温度 １ １ｏ 。据 ．～ ． ４ ２ Ｃ下灭 菌 ２ ｎ ０ｍｉ。 基 础 种 子 培 养 基 ：牛 肉膏 为 ０３ ， 蛋 白 胨 为 ． ％ 病 的人大约有 １ ０ ０万人 ，潜在 的溶栓剂市场有 ２ ５ ０
３ １８９ Ｕｍ ｙｔｅｆ ｔｓｌ ｔ ｎａｄ ｔｅｓｃｎ ｅ ｃｏ ． ｃｏｄｎ ｏｐ ｏ ｇｃｌ ｐ ｙｉｏ ｃ ｄ ｂ ｃ ｅ ｉ ． Ｉ／ Ｌ ｂ ｒ ｅ ｃ ｏ ｎ ｅｏ ｄ ｓｌ ｔ ｎ Ａ ｃｒｉｇｔ ｍ ｒｈｌ ｉａ， ｈ ｓ ｌｇ ａ ａ ｉ ｈ ｍｃ ５ ７ ｈ ｉ ｓ ｅｉ ｈ ｅｉ ｏ ｏ ｏ ｉｌｎ ｏ ｌ ａ
收 稿 日期 ：２ ０ — ４ ０ ０７０— ２ 基金项 目：黑龙江省教育厅 ：纳豆激酶发酵工艺条件及产业化提取的研究 （０ ４ １ ０ 。 １５ １５ ）

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纳豆激酶分离纯化技术的研究

纳豆激酶分离纯化技术的研究

第 22 卷 第 3 期 2008 年 9 月
山 东 轻 工 业 学 院 学 报 JOURNAL OF SHANDONG INSTITUTE OF LIGHT INDUSTRY
文章编号 :1004 - 4280 (2008) 03 - 0024 - 04
纳豆激酶分离纯化技术的研究
0 引言
纳豆激酶 (Nattokinase ,NK) 是日本学者须见洋 行从日本食品纳豆中纯化分离出的一种具有溶血栓 功能的丝氨酸蛋白酶 ,它是由枯草杆菌 ———纳豆菌 ( Bacillus natto) 发酵大豆后所产的酶[1] 。由于 NK 作 用迅速 ,维持时间长 ; 源于食品 ,安全性好 ; 分子量 小 ,是一个单链蛋白质 ,更易被人体消化道吸收 ;对 纤维蛋白的作用机制不同于尿激酶等现用于临床的 药物 ,它同其他纤溶酶一样直接作用于纤维蛋白 ,同
Phenyl Sepharose 疏水柱层析 Sephadex G2150 凝胶过滤层析 Sephadex G2100 凝胶过滤层板
第 22 卷
SDS - PAGE 测得 分子量ΠkDa
—
28 28 28 和 38
纯化倍数酶率活Π回%收
①4. 75 ②1. 32
—
①74. 3 ②77. 0
—
50
40
产品的生产主要是发酵液经过一系列的分离纯化方
具有操作简便 、可规模化生产及选择性强等特点 ,广 泛应用于规模化工业生产中 。基本工艺流程是离心 除菌 →盐析 (或有机溶剂沉淀) →超滤浓缩 →凝胶过 滤层析脱盐 →离子交换层析或疏水层析 。一般是将 凝胶层析 、疏水层析 、亲和层析和离子交换层析中两 种以上的层析方法配合使用来进行酶的分离 。
膨胀床吸附分离作为一种新型的蛋白质分离纯 化方法 ,其主要原理是根据静电吸附作用 ,将带有相 反电荷的蛋白酶吸附在离子交换柱上 。该分离方法 避免了柱层析分离过程中 ,因复杂的纯化步骤而导致 纳豆激酶失活的缺点 ,具有快速分离纯化的优点。胡 洪波等[17] 对膨胀床分离纳豆激酶过程的各个阶段进 行了考察 ,发酵液中经离心得上清液 ,将粗酶溶液的 pH 值调节至低于其等电点 ,采用 Streamline SP 强离子 交换吸附剂 ,Streamline 25 膨胀床柱 ,XK16 层析柱 ,吸 附时最佳的 pH 为 6. 0 ,电导率应低于 6. 2 msΠcm。然 后进行清洗解吸 ,得到比较纯的纳豆激酶 ,整个分离 过程缩短为 8～10 h ,回收率提高了约 50 %。
中国传统纳豆中纳豆菌的分离筛选及其发酵特性初步研究

中国传统纳豆中纳豆菌的分离筛选及其发酵特性初步研究

中国传统纳豆中纳豆菌的分离筛选及其发酵特性初步研究付志英;丁玲;彭宏
【期刊名称】《中国调味品》
【年(卷),期】2016(000)001
【摘要】根据待分离菌株的耐热性、菌落形态特征和个体形态特征进行初筛，脱脂牛奶水解试验复筛，分别从纳豆胶囊分离纯化得到菌株 C-1，从加纳豆胶囊的纳豆中分离纯化出菌株 D-1，从不加菌种制作的传统纳豆（中国民间做法，不加任何菌种制作的纳豆）中分离纯化得到菌株 F-1，并对这3个菌株进行理化试验，结果均与枯草芽孢杆菌的特性一致。

同时对 C-1和 F-1两个菌株产生纳豆粘液的拉丝情况和得率进行了考察，结果表明：F-1比 C-1纯种纳豆的拉丝长5．94 cm，粘液产率高1．62％。

【总页数】7页(P56-61,67)
【作者】付志英;丁玲;彭宏
【作者单位】福建农业职业技术学院，福州 350119;福建农业职业技术学院，福州 350119;福建农业职业技术学院，福州 350119
【正文语种】中文
【中图分类】TS214.9
【相关文献】
1.纳豆菌培养条件的初步研究 [J], 满丽莉;向殿军
2.传统纳豆中纳豆菌分离筛选的初步研究 [J], 陈锡雄;阮俊锋;高文;郭团玉
3.紫菜纳豆菌发酵物中醇提物和多糖生物活性的初步研究 [J], 黄莺莺;董焕焕;杨苗苗;矫丽萍;邵霜;岳琪;魏玉西
4.纳豆菌的分离、筛选、鉴定及发酵特性对比研究 [J], 王欢;李宏梁;杜磊;尉璐杰
5.溶栓纳豆菌的筛选鉴定及其发酵特性研究 [J], 董明盛;江晓;江汉湖;陈伯祥
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纳豆激酶品种介绍

纳豆激酶品种介绍



第三代溶栓剂
为提高溶栓剂的特异性，半衰期及溶栓效率，人们应用现代分子生物学技术， 对第一代和第二代溶栓剂进行改进，得到了各方面效能有较大提高的新型 溶栓剂 。第三代溶栓剂主要包括突变体、嵌合体及导向体3大类 。
3、纳豆激酶溶栓特点
3.2纳豆激酶溶栓特点
虽然第三代溶栓剂具有更优良的应用前景，但目前大多还处于实验 室研究阶段，离投入应用还遥未有期；而且由于涉及复杂的技术并依 赖基因工程菌进行生产，势必供给有限、价格不菲。 纳豆激酶是目 前发现的近200种具有口服溶纤作用的物质中最具潜力的溶纤蛋白酶。 在体外试验中可以看到纳豆激酶与纤维蛋白溶酶原共同作用可以明显 的溶解纤维蛋白凝块。在以大鼠为对象的动物实验中，经过静脉注射 发现纳豆激酶的纤溶能力是血纤维蛋白溶酶(plasmin)的4倍以上。健 康人口服纳豆激酶的实验表明，纳豆激酶可以明显缩短优球蛋白溶解 时间、增加血栓溶解面积和血栓分解产物。因此，纳豆激酶不仅可用 于静脉注射，还有很好的口服效果。 在众多第二代溶栓剂中，纳豆 激酶以其来源广泛、价廉易得，溶栓活性高、特异性强、 副作用小，可口服，使用方便、安全的优点，得到了国内外 研究者的青睐，成为目前溶栓剂研究的热点。
298元/60粒/瓶
5
制剂
胶囊
332元/ 120粒/瓶
三、纳豆激酶市场开发现状

3.2国内生产厂家
生产厂家 品名 清血酶纳豆胶囊 品种 制剂 剂型 胶囊 产品定位 规格售价 166元/盒
序 号
6
辽宁得益堂健康会馆
纳豆干品
纳豆激酶冻干粉 金纳通肠溶胶囊 净血纳豆胶囊纳 豆冻干粉 酒管家●纳豆素 胶囊 诺金康纳豆胶囊 诺通纳豆胶囊 诺苷纳豆胶囊 诺清纳豆胶囊 纳豆冻干粉
纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究

纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究

纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究纳豆是日本的传统大豆发酵食品，由纳豆芽孢杆菌发酵而成，在日本已食用近千年。

1987年，须见洋行等经过对上百种食物的筛选，首次发现纳豆含有溶解血栓纤维蛋白的成分，并命名为纳豆激酶(nattokinase,NK)。

研究表明，NK 是纳豆发酵过程中纳豆芽孢杆菌分泌的一种丝氨酸蛋白酶[1]。

进一步的研究表明，NKc具有很强的体内外溶栓作用，与传统的容栓剂相比，NKc具有易提取、成本低廉和能口服吸收溶栓等优点，因而可能成为新一代的溶栓药物[2-4]。

为了对NKc的开发提供理论依据，本实验室在研究NKc纤溶活性之后，进一步对其体外溶栓和溶血作用进行研究。

1 材料与方法1.1 材料菌株：为本实验室自日本纳豆分离纯化菌种，保存于养琼脂斜面，营养琼脂配方为：细菌培养用胰蛋白胨(bacto-tryptone)，1%；细菌培养用酵母抽提物(b acto-yeast extract)，0.5%；NaCl,0.5%；细菌培养用琼脂粉(bacto-agar powd er)，1.5%PH7.2。

纳豆、纳豆提取液：按文献[5]介绍方法制备。

血平板：用生理盐水配制1%琼脂，加入新鲜脱纤兔血，混匀倾注平板，冷却凝固即成。

主要试剂：凝血酶、纤维蛋白原、标准尿激酶（中国药品生物制品检定所）；蚓激酶(30×104 U•粒-1，北京百奥药业有限责任公司)；牛血清白蛋白(上海生化试剂公司)；低相对分子质量标准蛋白质(兔磷酸化酶：Mr97.4×103,牛血清白蛋白：Mr66.2×103,兔肌动蛋白：Mr43.0×103,牛碳酸酐酶：Mr31.0×103,胰蛋白酶抑制剂：Mr20.1×103,鸡蛋清溶菌酶：Mr14.4×103)（上海生化试剂公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 NKc分离纯化纳豆提取液经35%～75%饱和度硫酸铵分段盐析，离心收集沉淀，用50mmol•L-1磷酸缓冲液（PH 7.4）溶解，充分透析后获得纳豆激酶粗酶（NKc），再经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱（1.0cm×60cm）层析，分管收集纤溶活性较高部分，脱盐，冷冻干燥后获得层析纯纳豆激酶（NKc），SDS-PAGE电泳检测纯度。