酵母双杂交相关实验方法
1、酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法）
1、酵母质粒提取试剂
Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol
0.1mol/L EDTA
Buffer II 50mM/L Tris
20mM/L EDTA
Buffer III 10mM/L Tris
1Mm/L EDTA
2、操作步骤：
(1) 收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶
（30mg/ml）。.
(2) 37℃水浴1h。
(3) 10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。
(4) 加入25μl 10% SDS，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一
次。
(5) 加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。
(6) 4℃12000rpm离心15min，取上清。
(7) 在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小
时以上。
(8) 取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。
(9) 加入150μl buffer III 溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽
提。
(10) 12000rpm离心15min。
(11) 将上清转入新的离心管中，加入6μl(10U/μl)RNA酶 37℃放
置30min。
(12) 取上清，加入等体积的异丙醇。
(13) 4℃静置10min，1小时以上或过夜。
(14) 4℃10000rpm 离心5min。
(15) 弃上清，并把沉淀溶于10μl buffer III 中。
2、 小规模酵母转化
1、酵母转化试剂：
转化用试剂除PEG采用过滤灭菌外，其它试剂均需高温高压灭菌，条件同普通培养基灭菌。
(1) M 醋酸锂（Lithium Acetate）
(2) 聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）分子量3350，浓度 50%
（w/v）
(3) PEG/LiAc 溶液的配制（现用现配）
800μl 50%PEG
100μl 10×TE
100μl 10×LiAc
1ml 总体积
(4) 1.1×TE/LiAc溶液（现用现配） 11ml 10×TE
(5) 11ml 10×LiAc
(6) 78ml ddH20
2、操作步骤：
(1) 第一天下午3点将酵母接种于5ml YPDA中，30℃摇菌。
(2) 第二天上午10点测OD600，转2.5×108个于50ml YPAD中。
(3) 下午3:00收集菌体。
(4) 室温离心，700g，5min。
(5) 弃上清，用60ml 灭菌ddH20重悬细胞。
(6) 室温离心，700g，5min。
(7) 弃上清，用3ml 1.1×TE/LiAc 重悬细胞。
(8) 1.5ml/管分装细胞。
(9) 12000rpm离心15-30s。
(10) 弃上清，每管加入600μl 1.1×TE/LiAc重悬细胞，100μl分
装到1.5ml管中。
(11) 冰上准备转化混合物(与收集菌体同步进行)：
PEG3350 (50%) 240μl
LiAc (1.0M) 36μl
Carrier DNA (10mg/ml) 10μl
质粒 2μl（总量大于100ng）
ddH20 32μl
总体积 360μl
(12) 12000rpm离心15-30s除去1.5ml离心管中的液体，将转化
混合物加入并与感受态细胞剧烈混匀。
(13) 30℃温浴30min,每15min混合一次。
(14) 加入20μl DMSO,混合，然后在42℃水浴15min,每5min混合
一次。
(15) 12000rpm离心30s，吸弃转化混合物。
(16) 加入1ml YPDA重悬细胞。
(17) 30℃温浴90min。
(18) 12000rpm离心15s
(19) 弃上清，用1ml NaCl(0.9%)重悬细胞。
(20) 稀释100-1000倍涂选择性平板（SD/-Trp或SD/-T-L，SD/-
T－L－H等）。
(21) 37℃培养2-3天可见长出的菌落。
3、β-半乳糖苷酶活性检测
1、 β-半乳糖苷酶活性检测试剂：
(1) Z buffer
Na2HPO4·12H2O 21.5g/L
NaH2PO4·2H20 6.22g/L
KCl 0.75g/L
MgCl2.6H20 0.226g/L
PH 7.0，高压灭菌
(2) X-gal
溶解X-gal 于DMF中，浓度20mg/ml。
(3) Z buffer/X-gal 溶液
Z buffer 100ml
β-巯基乙醇 0.27ml
X-gal 1.67ml
2、操作步骤：
(1) 用牙签挑取三缺大平板上长出的单菌落,划线到到新的二缺
和三缺平板(SD /-His/-Leu/-Trp)的平板上,同时每个板均涂上正
负对照（正对照含pGADT7-ReT和pGBKT7-53质粒的酵母，负对照：pGADT7-ReT和pGBKT7-Lam质粒的酵母），30℃培
养，2d。
(2) 三缺平板放于4℃保存，二缺用于X-gal显色。
(3) 用牙签将菌挑二缺平板上的菌体涂到滤纸上，液氮上漂浮
30s，再37℃保温1-2min，重复液氮30s
(4) 取出置于室温，晾干后将滤纸放于经底物溶液（Z buffer,
0.1% X-gal）润湿的普通滤纸上，避光于37℃，温浴4h,观察滤
纸颜色的变化并记录。
