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药用真菌粗多糖蛋白含量测定方法

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药用真菌粗多糖蛋白含量测定方法

以药用真菌姬松茸(Agaricus blazei)、鸡腿菇(Coprinus comatus)、猴头(Hericium erinaceus)、灰树花(Grifola frondosa)和灵芝(Ganoderma lucidum)的水提多糖为材料,采用二喹林甲酸法、考马斯亮蓝法、福林-酚法、紫外分光光度法、离子色谱法和传统凯氏定氮法对其中的蛋白含量进行测定和比较分析。结果表明,不同测定方法获得的蛋白含量测定值有差异;笔者推荐使用离子色谱法进行精确蛋白含量测定,采用福林-酚法进行快速趋势比较测定。

药用真菌; 多糖; 蛋白含量; 福林 酚法; 离子色谱法

近年来,国内外针对药用真菌保健功能的研究越来越广泛,其中有关药用真菌水提多糖的研究数量明显增多。由于水提粗多糖中含有部分游离蛋白,所以蛋白含量成为粗多糖常见检测指标[1]。目前蛋白检测常用方法有凯氏定氮法、考马斯亮蓝法、二喹林甲酸法、福林-酚法、紫外分光光度法等,还出现了利用离子色谱分析氨基酸来计算蛋白质含量的离子色谱法,笔者以5种常见药用真菌的水提粗多糖为试验材料,采用上述6种测定方法进行蛋白含量测定,比较各方法的测定值和重复性,并对各测定方法优缺点进行分析。

1 材料与方法

1.1试验材料

姬松茸(A. blazei)、鸡腿菇(C. comatus)、猴头(H. erinaceus)、灰树花(G.

frondosa)、灵芝(G. lucidum)子实体购自磐安市场,粉碎过80目筛后,参照文献[2,3]的沸水提取方法进行粗多糖提取,水提物冷冻干燥后得干粉。每种药用真菌3个平行样,充分混匀后用于蛋白含量测定。

1.2蛋白含量测定方法

1.2.1二喹林甲酸法(BCA法)

使用Applygen公司提供的BCA法蛋白浓度定量试剂盒,参照文献[4]对各水提多糖样品进行蛋白含量测定。

1.2.2考马斯亮蓝法(Bradford法)

使用GENMED Bradford 蛋白浓度定量试剂盒,参照文献[5]进行测定。

1.2.3福林-酚法(Lowry法)

使用上海荔达提供的Lowry法蛋白测定试剂盒,参照文献[6]进行测定。

1.2.4紫外分光光度法(UV法)

使用BIO TEK Synergy HT酶标仪,参照文献[7]进行测定。

1.2.5凯氏定氮法(Kjeldahl法)

使用上海市农业科学院质量标准检测中心的Kjeltec8100型凯氏定氮仪(FOSS公司),参照文献[8]进行测定。

1.2.6离子色谱法(HAPEC PAD法)

使用戴安公司高效阴离子交换色谱-安培检测器(HAPEC PAD),型号Dionex

ICS 2 500,色谱条件:Amino Pac PA 10柱 (2 mm×250 mm),流速0.22 mL/min,柱温30 ℃,流动相为0.25 mol/L NaOH和1 mol/L Na2Ac,上样量20 μL;以Thermo

Scientific生产的17种标准氨基酸为标准品,将检测到的样品中氨基酸摩尔浓度按照各自氨基酸分子量换算加和后为样品中总蛋白质含量[9]。

2 结果与分析

2.1不同检测方法的标准曲线

BCA法标准曲线方程为y = 5.646x+0.0847(R2 =0.9911),在0.0125～0.1

mg/mL浓度范围内线性良好。Bradford法标准曲线方程为y = 0.0369x+0.3177 (R2

= 0.9995),在0.078～0.625 mg/mL浓度范围内线性良好。Lowry法标准曲线方程为y = 0.2571x+0.0975(R2 = 0.9954),在0.05～0.5 mg/mL浓度范围内线性良好。可以初步看出,BCA法适合浓度较低的蛋白含量测定,而Bradford和Lowry法适合的浓度范围则较广一些。

标准氨基酸离子色谱图及浓度与峰面积关系如图1所示,各氨基酸标准品峰型均匀对称,并且分布均匀。

图1 17种标准氨基酸离子色谱图

Fig.1 HAPEC PAD chromatogram of 17 amino acid standards

周 帅,等:药用真菌粗多糖蛋白含量测定方法

2.2不同检测方法的测定结果分析

药用真菌姬松茸、鸡腿菇、猴头、灰树花、灵芝的水提多糖样品采用不同测定方法获得的蛋白含量分布如图2所示,可以看出,6种供试测定方法中,UV法测得的数值最高,而Bradford法所测数值(姬松茸粗多糖除外)最低,BCA法、Kjeldahl法和Lowry法所测结果介于前两者之间。UV法测定值是依据经验公式计算获得

的,相对于实际含量偏高;而Bradford法,在供试样品浓度下,测定过程中颜色反应不明显,故灵敏度较低;凯氏定氮法的测定值包含样品中无机氮含量在内[8],Lowry法只测定样品中酪氨酸和色氨酸含量[10],BCA法易受葡萄糖、蔗糖等糖类干扰[11],而离子色谱法测定值则由氨基酸含量计算获得,可以初步判断,离子色谱法测定值相对于其他5种测试方法的测定值更接近实际含量值。

从药用真菌种类来看,不同测定方法对姬松茸水提物中蛋白含量的测定值差异最小(为13.95%～29.16%),而灵芝水提物中蛋白含量的测定值差异较大(11.8%～111.84%),灰树

图2 不同检测方法的蛋白含量测定结果

Fig.2 Protein content of five polysaccharide preparations determined using six

different methods

花、猴头、鸡腿菇总提物中蛋白含量的测定值差依次减小,这说明对于不同种类的药用真菌来说,其粗多糖中蛋白含量的准确测定对测定方法的要求程度有所不同。

同时还对各测定方法的测定值进行了重复性RSD值计算,如表1所示。

表1 不同检测方法的重复性RSD值

Table 1 RSD values for protein contents determined using different methods

测定方法

Method

药用菌 Medicinal fungus

姬松茸A. blazei鸡腿菇C. comatus猴头H. erinaceus灰树花G. frondosa灵芝G. lucidum

UV1.29(3)1.48(2)1.49(3)3.58(5)6.03(4)

BCA3.40(5)2.14(5)2.56(6)1.55(4)1.21(3)

Bradford6.67(6)5.26(6)1.27(2)5.79(6)16.28(5)

Lowry3.35(4)1.26(1)1.81(4)1.20(3)0.90(2)

Kjeldahl0.51(1)1.74(3)0.99(1)0.82(2)1.21(3)

HAPEC PAD0.69(2)1.82(4)1.95(5)0.47(1)0.06(1)

表中数据是蛋白质在粗多糖中的质量百分比,括号内的数值为该测试方法RSD在6种测试方法中的排位

Values shown represent the protein content (%) of the crude polysaccharide

preparations,values in parentheses represent the order of RSD values among the six

test procedures

从重复性RSD结果来看,Kjeldahl法检测结果重现性最好,其次是HAPEC

PAD法和Lowry法,然后是UV法和BCA法,Bradford法检测结果重现性最差。

在具备较好的准确性的同时,离子色谱法也具有和凯氏定氮法类似的测定耗时较长的缺点,需要在样品预处理和测定时花费较多的时间,适用于对准确度有较高要求的测定。而用比色法(Lowry法、UV法BCA法和Bradford法)测定药用真菌水提多糖中蛋白含量普遍节省时间,尽管这些方法的准确程度会在不同程度上受到干扰物质的影响。

3 结论

通过对本试验结果进行分析比较发现,6种蛋白含量测定方法中,离子色谱法相对于其他测定方法更准确,而Kjeldahl法相对于其他测定方法重复性好,但二者测定时间均较长;而Lowry法和BCA法测定结果偏高,重复性稍差,但测定时间较短;Bradford法和UV法则准确度不高,重复性也较差。综合上述分析,笔者认为:对于药用真菌多糖中的蛋白含量检测方法的选择可以从以下2个角度进行:1、从准确检测角度,笔者推荐离子色谱法;2、从快速检测、分析趋势而不要求准确含量的角度,推荐使用Lowry法。

张安强,张劲松,潘迎捷. 食药用菌多糖的提取、分离纯化与结构分析[J]. 食用菌学报,2005,12(2):62 68.

[2] 贾薇,刘艳芳,张劲松,等. 姬松茸菌丝体多糖提取方法初探[J]. 食用菌学报,2003,10(3):41 44.

[3] 杨阳,刘承初,贾薇. 灰树花多糖的超滤分离及免疫活性研究[J]. 食品科学,2008,29(9):277 280.

[4] SMITH PK,KROHN RI,HERMANSON GT,et al. Measurement of protein

using bicinchoninic acid[J]. Anal Biochem,1987,163(1):279.

[5] BRADFORD MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of dye binding[J]. Anal

Biochem,1976,72(7): 248 254.

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测蛋白、多糖的方法

测蛋白、多糖的方法

一、硫酸苯酚法测多糖含量

1、试剂配制

① 浓硫酸：分析纯，95.5%

② 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配）

③ 5%苯酚：取苯酚100 g，加铝片0. 1 g和碳酸钠0. 05 g，常压蒸馏,收集182℃馏分。称取该馏分(100%苯酚)5 g，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中，冰箱中冷藏储存备用。

④ 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。准确称取20m g经105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品于500ml容量瓶中，蒸馏水溶解定容。

2、制作标准曲线

准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后加入6%（5%，9%）苯酚0.5ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

1

2 3 4 5 6 7 8 0

标准葡萄糖溶液（mL） 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0

蒸馏水（mL） 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1.0

6%苯酚（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

浓硫酸（mL） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

3 注意事项

（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。

（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。 （3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算

虫草多糖的分离纯化及含量测定

虫草多糖的分离纯化及含量测定

虫草多糖的分离纯化及含量测定

目的 采用发酵法从冬虫夏草发酵液及菌丝体中提取、分离虫草多糖。 方法

采用乙醇沉淀法分离冬虫夏草发酵液和菌丝体中的多糖；采用苯酚硫酸法测定样品中多糖含量。 结果 采用此法进行制备、检测，方法简单快速，结果准确，适宜推广使用。结论 此法无需多糖纯品，具有快速简单、精确度高、灵敏度高、重现性较好的优点，是检测虫草多糖含量的较优方法之一。

标签：发酵液；虫草多糖；菌丝体虫草多糖；分离纯化；含量测定

Purification and determination of Cordyceps polysaccharide

CUI?Lixun1??ZHANG?Aihua1??SUN?Shouying2

1.Heilongjiang Biotechnology Vocational College，Harbin 150025，China；2.Heilongjiang New Yisheng Pharmaceutical Co.，Ltd，Jixi 158200，China

[Abstract] Objective Using the method of inoculated fermentation to extract and

separate the Cordyceps polysaccharide from the zymotic fluid and mycelium of

Chinese caterpillar fungus. Methods Separated the polysaccharide of Chinese

caterpillar fungus’ zymotic fluid and mycelium in ethanol precipitation；survey and

evaluate the polysaccharide content of samples in phenol-sulfuric acid method.

多糖含量测定方法

多糖含量测定方法

1 / 2 多糖含量的测定

粗多糖中的总糖含量使用苯酚-硫酸法进行测定，还原糖用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定，多糖含量 = 总糖 - 还原糖。

1、总糖含量测定

实验原理：

多糖在硫酸作用下，先水解成单糖，并脱水生成糖醛衍生物，与苯酚生成橙黄色溶液，在490nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。

试剂：

浓硫酸（分析纯）、5%苯酚溶液（分析纯）、标准葡萄糖。

操作步骤：

① 制作标准曲线：准确称取105 ℃烘干至恒重的葡萄糖50mg于500ml容量瓶中配成0.1 mg/ml 的标准溶液，用蒸馏水分别配成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/ml。1 ml标准液分别加入 5% 苯酚溶液1 ml，并迅速加入浓硫酸5 ml，静置10 min。摇匀，30℃放置30 min后于490nm测定OD值，以葡萄糖含量为横坐标，OD值为纵坐标，制作得到标准曲线。

② 样品含量测定：吸取1.0ml样品液，按照上述步骤操作测定OD490，并代入标准曲线计算样品的总糖含量。

2、还原糖含量

实验原理

碱性条件下，DNS可与还原糖反应生成3-氨基-5-硝基水杨酸。此物质在煮沸条件下成棕红色，且颜色深浅在一定范围内与还原糖含量成线性关系。据此可通过测定OD值确定还原糖含量。

试剂及配制：

浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液。DNS显色液：称取3.25g DNS溶于少量蒸馏水中并转移至500ml容量瓶中，加入2mol/L的NaOH溶液162.5ml，再加入7.5ml的丙三醇，摇匀，加蒸馏水定容至500ml，摇匀。

操作步骤

① 标准曲线制作：在6支试管中分别加入1mg/ml葡萄糖标准溶液0.00ml，0.10ml，0.20ml，0.30ml，0.40ml，0.50ml，补蒸馏水至0.5ml，然后加入

DNS试剂1.5ml，充分混匀。置于沸水浴中煮沸5min，然后迅速流水冷却，并分别向试管中加入4ml蒸馏水，混匀。在540nm处读OD值。以葡萄糖浓度（μg/ml）为横坐标，以OD值为纵坐标制作标准曲线，得到其线性回归方程。

2015版药典多糖含量测定方法

2015版药典多糖含量测定方法

2015版药典多糖含量测定方法

宝子们！今天咱们来唠唠2015版药典里的多糖含量测定方法。

在这版药典里呢，多糖含量测定有它特定的一些小讲究。一般来说啊，会有化学方法之类的。比如说，有的是利用多糖与某些化学试剂发生反应，然后通过检测这个反应产物的量来间接推算多糖的含量。就像一场神秘的化学反应小魔术一样。

其中一种常见的方法可能涉及到水解多糖。把多糖分解成小分子，这样就更容易去测定啦。这就好比把一个大的东西拆成小零件，然后数小零件的个数就能知道原来大东西大概有多少啦。而且在这个过程中，对于反应的条件要求还挺严格的呢。温度啊、反应时间啊，就像给这个小魔术设定了特定的咒语，差一点都可能影响最后的结果。

还有哦，在检测过程中，仪器的使用也很关键。可能会用到像分光光度计这样的仪器。这个仪器就像是一个超级侦探，能够发现那些我们肉眼看不到的微小变化。它通过检测光的吸收情况，来判断多糖含量相关的一些指标。操作这个仪器的时候，可得小心翼翼的，就像对待一个超级脆弱的小宝贝。

另外呢，样品的处理也是个大学问。要确保样品具有代表性，就像从一群小伙伴里挑出几个能完全代表大家的一样难。在提取多糖的时候，要把杂质尽可能去掉，不然杂质就像捣蛋鬼一样，会干扰最后的测定结果。

不过呢，这个2015版药典里的多糖含量测定方法虽然有点复杂，但它可是为了保证药品质量的重要一环呀。就像一个严格的守门员，不让不合格的多糖含量的药品混进市场。它保障着我们用药的安全和有效性，是不是感觉它还挺厉害的呢？虽然咱们不是专业的研究人员，但是了解一点这样的知识，也能让我们对药品的质量控制有个大概的认识啦。下次再看到关于多糖的药品，说不定还能跟身边的人小吹一下牛呢，哈哈。