HRP辣根过氧化酶的底物

●产品简介※ Galaxybio 公司研发的活化HRP，对优质辣根过氧化物酶次序偶联，再活化，使辣根酶富含活性基团。

一经活化的HRP，极易和含氨基NH2的小分子或蛋白氨基NH2的共价结合。

因此使用本方法标记物，具有标记率高、活性好、本底低及非常敏感等特点。

敏感性一般是传统过碘酸法标记3~5倍。

微量包装的活化HRP，特别适合科研用的昂贵抗体的标记。

也适合抗体抗原活性的检测。

※一步标记，简便快速。

与待记抗原或抗体混合后（约12个小时过夜标记或37℃2小时。

）※可以微量标记，节省昂贵的抗原抗体※无需透析，即时使用；※标记率极高，可大于95%；敏感性一般是传统过碘酸法标记3~5倍。

※本试剂盒针对氨基进行标记，故只对含有氨基的分子。

可以进行抗原或其他蛋白的标记。

小分子的标记，如瘦肉精、DNA、多肽等等，标记时，如要提高HRP的利用率，可以加入过量的小分子，然后透析除去游离的小分子；如果要即时使用，参考蛋白抗原的标记，减少小分子的用量，从而减少游离的小分子。

※本底远远低于其它方法。

●注意事项：1. 抗原抗体如果是存在于硫酸铵、甘氨酸或Tris缓冲液中，需以PBS缓冲液充分透析，也可以超滤离心管进行超滤；微量的含NH2 的小分子，会严重影响标记率。

2. 反应体系一般100μl～300ul /1mgHRP；太小，可能发生自身交联；也不要太大，太大会影响标记率。

3. REAGENT Ⅲ 终止液，封闭残余活化基团。

4. 注意反应 pH值约维持在9.5左右。

pH值太低，多加反应启动剂。

5.特别提醒，是后续试验中，酶标板条种类不同，本底差异特别大。

当本底高时，以较高浓度蛋白溶液封闭的酶标板，同时把酶标稀释液的蛋白浓度加大。

如果问题依旧存在，请联系我们技术咨询。

6 本试剂仅用于科学研究；●操作步骤：以1mg活化HRP，标记抗体为例（反应体系根据HRP的mg数相应增加）1. 准备待标记物：以蒸馏水或超纯水把待标记物溶解成约1mg/ml。

北京梅科万德生物科技有限公司地址：北京市海淀区西小口路27号西三旗生态园商服北楼2203号TMB 显色液（双组份，用于ELISA )产品编号：1001 AB TMB 显色液双组份，用于标记物为辣根过氧化物酶的ELISA ；超稳定，使用方便，高灵敏度。

TMB 显色液（双组份）分为A 液、B 液两部分，A 液主要成分是过氧化氢，包装于白色瓶中；B 液的主要成分是3,3’,5,5’ –四甲基联苯胺（3,3’,5,5’ - tetramethylbenzidine (TMB)），包装于棕色瓶中，避光保存； TMB 是辣根过氧化物酶（HRP ）的底物，在辣根过氧化物酶的作用下，与氧化剂过氧化氢反应生成蓝色产物。

颜色的强弱与HRP 的活性呈正比，从而可以用于检测基于HRP 标记物的检测。

规格本产品包装规格（A+B ）为100ml 、500ml 、1000ml 、2000ml运输、储存和有效期常温运输(勿超过30°C)， 2-8°C 储存，在有效期内使用。

正常储存条件下自生产之日起有效期2年。

注意事项∙应用: 本品适合于标记物为HRP 的ELISA 实验，本品中含有的TMB 和过氧化氢，在HRP 的作用下，TMB 被氧化形成水溶性蓝色产物，在370nm 和650nm 有吸收峰。

进行动力学实验时，可直接检测650 nm 的吸光度。

加入终止液，可进行终点法检测。

终止液可以选择0.1%NaF ，终止后TMB 的颜色不变，在650nm 检测，也可肉眼观察定性判断。

加入酸性终止液后变成黄色，检测波长为450 nm ，吸光度值可较不酸化增加数倍。

∙ 注意事项: 1. 本产品对各种氧化剂敏感，应在使用过程中避免污染，切忌将枪头直接插入瓶中取液，应倒出所需要液量，剩余溶液不要倒回原包装瓶中以免污染。

2. 操作过程中避免阳光的直射，分装的容器建议用塑料容器，避免使用金属容器以及细菌和氧化还原剂污染的容器。

背景介绍
酶联免疫分析技术（ELISA）广泛应用于抗原、半抗原或抗体的定量或定性分析，辣根过氧化物酶（HRP）是 ELISA 技术最常用的一种酶，能催化底物如 3,3'5,5'-四甲基联苯胺（TMB）发生显色反应，从而进行定量或定性分析。

由于 TMB 比其他显色底物具有更高的灵敏度且无致癌性、故而被广泛使用，TMB 主要应用于 ELISA、WB、免疫斑点杂交或免疫组化等实验，也有报道将其用于氯的检测分析等。

TMB工作原理
HRP 或其他适当过氧化物酶能催化TMB生成可溶的蓝色产物，此时通常可在 370nm 测定吸光度。

当显色反应被酸性溶液（如 0.5-2M H2SO4，0.5M HCl，1M H3PO4）终止后，产物由蓝色转为黄色，此时可在 450nm 测定吸光度。

传统TMB显色液（双组分）
通常 TMB 显色试剂以双组分（A/B液）的形式提供，分别含H2O2和TMB，需要在使用前按1:1比例配制，具有以下缺点：
▲较容易产生沉淀；
▲使用起来相对不便；
▲较易导致检测结果误差。

爱必信单组分TMB显色液优势
作为高品质生命科学产品的中国品牌，爱必信生物研发推出的abs9178 单组分TMB显色液，显色试剂由单一溶液组成，有效简化了操作步骤，并且检测结果更加稳定可靠。

其具有以下优势：
▲即用型溶液，含H2O2和TMB，单组分溶液形式，无需混合，方便快捷减少误差；
▲检测灵敏度高，线性浓度范围宽；。

HRP标记抗体原理及方法（戊二醛二步法和过碘酸钠法）酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA 等。

酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。

酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。

酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。

目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。

高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。

在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。

(一) 酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。

但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。

目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。

由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。

HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。

HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。

酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。

HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的纯度。

高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。

RZ值越小，非酶蛋白就越多。

值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。

HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。

供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。

化学发光检测方法
化学发光检测方法是一种通过化学反应产生可见光或紫外光的方法来检测特定的化学物质或分析物的方法。

常见的化学发光检测方法包括：
1. 化学发光酶法：通过酶催化底物分解反应产生化学发光的方法。

例如，常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP），其催化H2O2氧化底物，产生可见光。

2. 化学发光物质法：使用特定的化学发光物质，如钆、铑络合物等，在特定的条件下被激发并发出特定波长的光。

例如，常用的化学发光物质是1,2-二羟基吡光（Luminol），在碱性条件下与氧反应产生化学发光。

3. 化学发光标记法：将感兴趣的化合物与化学发光物质标记在一起，通过果蝇、鱼、细菌等动物表达的化学发光标记物，使得特定化合物在特定条件下产生化学发光。

化学发光检测方法具有灵敏度高、选择性强、反应速度快、操作简便等优点，被广泛应用于生命科学、医学、环境分析等领域。

广州市外显子生物技术有限公司Http//DAB显色试剂盒（20×）说明书货号：S-1503规格：溶液A：10ml溶液B：10ml保存：-20℃避光密闭保存，一年有效，避免反复冻融；短期可2-4℃保存。

产品简介：DAB是过氧化物酶（POD）的显色底物，DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法，适用于辣根过氧化物酶HRP 标记的免疫印记或免疫组化反应。

过氧化物酶催化底物发生反应，于反应部位产生棕色沉淀物，免疫印记可直接在膜上显示条带；免疫组化标本显色时间一般为室温10-15分钟，随后在显微镜下观察显色情况，显色充分后应将标本及时脱水封固，其终产物可直接在光镜下观察。

操作说明：1. 对于组织切片或蛋白质印记膜，在与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5 分钟。

2. 取900μl PBS（或双蒸水），加入50μl溶液A，50μl溶液B 混合均匀，即配成DAB工作液。

如需要更大体积工作液，可按比例放大。

此溶液必须现用现配，配好后避光保存，30min内使用，过期后请将剩余的液体废弃。

Http// 3. 向组织切片或印记膜上加入适量DAB工作液，确保能充分覆盖样品。

4. 室温避光孵育10-15 分钟或更长时间，避免光照，直至显色至预期深浅。

5. 去除DAB染色工作液，用蒸馏水洗涤2-3 次即可终止显色反应。

6. 对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可对其进行其他染料复染。

对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。

注意事项：1. DAB溶液应低温密封保存。

如有结晶析出，应确保结晶完全溶解再行使用。

2. 显色工作液应现用现配，新鲜配制的工作液应为无色或浅棕色，如颜色过深，请勿使用。

3. 显色时间严格控制，根据情况调整，以免显色过度。

固相膜显色数小时后即会褪色，不能永久存在。

4. DAB为可疑致癌物，请采取必要的防范措施。

操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。

dab染色原理引言：dab染色（Diaminobenzidine）是一种常用于免疫组化实验中的染色方法。

它可以帮助科学家观察和分析细胞或组织中的特定蛋白质、抗体等分子。

本文将详细介绍dab染色的原理及其在实验中的应用。

一、dab染色的原理dab染色的原理基于酶促反应。

在dab染色过程中，首先将样品与特定的抗体结合，形成抗原-抗体复合物。

然后，将辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗加入样品中，与抗原-抗体复合物结合。

最后，加入dab底物，HRP催化底物在存在氢氧化物离子的条件下发生氧化反应，产生可见的棕色沉淀物。

二、dab染色的步骤1. 样品制备：首先，需要对样品进行固定和包埋处理，使其保持形态和结构。

常用的固定剂有甲醛和乙酸乙酯等。

2. 抗原修复：有些抗原在固定过程中会发生变性，需要进行抗原修复，使其恢复原有的结构。

抗原修复的方法包括热处理、酶解等。

3. 阻断非特异性结合：为了降低假阳性的发生，需要使用一些非特异性蛋白质（如牛血清白蛋白）来阻断非特异性结合位点。

4. 抗体结合：将特异性的一抗加入样品中，与待检测的抗原结合。

5. 二抗结合：加入HRP标记的二抗，与一抗结合形成复合物。

6. 底物反应：加入dab底物，HRP催化底物发生氧化反应，产生棕色沉淀物。

7. 染色停止：通过水洗的方式停止底物反应，避免染色过度。

8. 盖片封装：将染色后的样品放置于玻璃盖片上，加入封片剂，固定样品并保护染色结果。

三、dab染色的应用dab染色广泛应用于免疫组化实验中。

通过对组织切片或细胞进行dab染色，可以观察和分析特定蛋白质的存在和分布情况。

例如，科学家可以利用dab染色技术来研究肿瘤组织中特定肿瘤标志物的表达，从而帮助诊断和治疗癌症。

dab染色还可以用于研究神经生物学、免疫学、细胞生物学等领域。

通过对脑片、淋巴组织、细胞培养物等进行dab染色，科学家可以研究神经元的连接、免疫细胞的活性以及细胞器的定位等。

总结：dab染色原理简单、灵敏度高，因此被广泛应用于免疫组化实验中。

酶标二抗的原理
酶标二抗是一种常用的免疫学实验技术，用于检测目标抗原的存在和浓度。

酶标二抗的原理如下：
1. 抗原结合：首先，在试验板上涂覆包含目标抗原的样品或抗原。

然后，加入第一抗体，也称为原抗体，它能够与目标抗原特异性结合。

2. 洗涤：洗涤试验板，以去除未结合的抗体和非特异性结合物。

3. 加入二抗：加入第二抗体，也称为酶标二抗。

这是一种特异性与原抗体结合的抗体，通常是兔源二抗。

酶标二抗结合位置可以人工设定，也可以通过先与目标抗体结合再加入试验板的方法实现。

4. 第二次洗涤：洗涤试验板，去除未结合的酶标二抗。

5. 酶标反应：加入特定底物，例如HRP（辣根过氧化酶）底物。

酶标二抗中的HRP将催化底物，产生显色或荧光等信号。

6. 信号检测：通过光度计或荧光分析仪等设备，测量产生的信号强度。

信号的强度与目标抗原的浓度成正比。

通过酶标二抗原理，可以高灵敏度地检测目标抗原的存在，并定量测定其浓度。

这种技术在生命科学研究、临床诊断等领域有着广泛的应用。

双倒数法测定过氧化物酶的米氏常数学院/专业/班级____________________________________________ 姓名_______________ 合作者___________________________________________________ 教师评定___________【实验目的】以过氧化物酶为例，掌握测定酶促反应初速率和米氏常数的原理及方法【实验原理】1913年，Michaelis 和Menten 运用酶反应过程中形成中间络合物的原理，首先提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式，即著名的米氏方程：[][]S K S V v m max +⋅= 式中：v 为反应初速率（微摩尔浓度变化/min ）；V max 为最大反应速率（微摩尔浓度变化/min ）；[S ]为底物浓度（mol/L ）；K m 为米氏常数（mol/L ）。

这个方程式表明当已知K m 及V max 时，酶反应速率与底物浓度之间的定量关系。

K m 值等于酶促反应速率达到最大反应速率一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。

不同酶的K m 值不同，同一种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似的反应酶与底物的亲和力大小：K m 越大表明亲和力越小；K m 越小表明亲和力越大。

大多数纯酶的K m 值在0.01~100 mmol/L 。

通过米氏方程的不同变形，可有多种求算米氏常数的方法，一般较常用的双倒数法，即取米氏方程的倒数式：[]max max m V 1S 1V K v 1+⋅=以v 1对[]S 1作图得一直线，该直线与横轴截距[]m K 1S 1=-。

过氧化物酶是一种对氢受体（H 2O 2） 底物有特异性，对氢供体底物缺乏特异性的酶，它可催化过氧化氢氧化许多多元酚或多元胺类底物发生显色、荧光或化学发光反应，可用于微量过氧化氢含量测定，也可以和其它酶反应系统偶联可用于测定许多与生命相关的物质：如葡萄糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及胆甾醇等，亦是免疫分子和核酸分析中常用的标记物。