㊃综述㊃基金项目:湖南省自然科学基金(2020JJ9007)作者单位:410007 长沙,湖南中医药大学第一附属医院药学部[王潇(硕士研究生)㊁文敏㊁郑沛(硕士研究生)㊁刘秋叶(硕士研究生)㊁左亚杰]作者简介:王潇(2001-),2022级在读硕士研究生㊂研究方向:中药药剂学㊂E⁃mail:1248946436@ 通信作者:左亚杰(1965-),硕士,教授㊂研究方向:中药药剂学㊂E⁃mail:yajiezuo@土鳖虫化学成分和药理作用的研究进展及其质量标志物(Q⁃Marker)的预测分析王潇 文敏 郑沛 刘秋叶 左亚杰【摘要】 土鳖虫是我国传统中药,分布于河南㊁河北㊁江苏㊁湖南等地,具有破血逐瘀㊁续筋接骨的功效㊂土鳖虫中化学成分种类丰富,主要包括蛋白质及多肽类㊁氨基酸类㊁脂肪酸类㊁生物碱㊁无机元素㊁核苷类等㊂现代药理研究表明,土鳖虫具备抗凝血并防止血栓形成㊁调节血脂的作用,此外,还具有抗肿瘤㊁抗炎㊁增强免疫力㊁抗氧化等作用㊂近年来,土鳖虫等动物类中药在临床应用方面备受关注㊂本文对土鳖虫化学成分和药理作用的研究现状进行总结,在此基础上分析功效作用与化学成分之间的联系,发现蛋白质及多肽类成分与抗凝血㊁调血脂作用关联紧密,生物碱类成分与抗菌抗炎作用相关㊂并从传统功效㊁现代药理㊁化学成分可测性㊁中药配伍等角度预测分析其质量标志物(quality marker,Q⁃Marker),初步确定土鳖虫活性肽组分㊁纤溶活性蛋白㊁脂肪酸类成分㊁生物碱㊁核苷类成分等可作为其质量标志物㊂中药质量标志物的研究为鉴定土鳖虫的真假优劣提供依据,也为后续开发土鳖虫新剂型㊁制定质量标准提供理论基础㊂【关键词】 土鳖虫; 蛋白质; 氨基酸; 脂肪酸; 生物碱; 调血脂; 抗肿瘤; 质量标志物【中图分类号】 R285 【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2024.05.035Research progress on chemical components and pharmacological effects of Eupolyphaga and predictive analysis on quality markerWANG Xiao ,WEN Min ,ZHENG Pei ,LIU Qiuye ,ZUO YajieThe First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine ,Changsha 410007,China Corresponding author :ZUO Yajie ,E⁃mail :yajiezuo@【Abstract 】 Eupolyphaga sinensis Walker is a traditional Chinese medicine (TCM),distributed inthe provinces of Henan ,Hebei ,Jiangsu ,Hunan and other places,and has the effect of breaking blood,stasis and bone.They are rich in chemical components,including proteins and polypeptides,amino acids,fatty acids,alkaloids,inorganic elements,nucleosides,etc.Modern pharmacological studies show that the Eupolyphaga sinensis Walker has the effect of anticoagulant blood,preventing thrombosis and regulatingblood fat.In addition,it also has anti⁃tumor,anti⁃inflammatory,enhancing immunity,anti⁃oxidation and other effects.In recent years,the application of TCM has attracted great attention in clinical practice.Inthis paper,we summarized the current status of chemical composition and pharmacological effects ofEupolyphaga sinensis Walker,and analyzed the connection between efficacy and chemical composition.Itwas found that protein and peptide components were closely related to anticoagulant and blood lipid effect,and alkaloid components were related to antibacterial and anti⁃inflammatory effects.The quality markers(quality marker,Q⁃Marker)were predicted and analyzed from the perspectives of traditional efficacy,modern pharmacology,chemical composition measurement and TCM compatibility,and the active peptidecomponents,fibrinolytic active protein,fatty acid components,alkaloids and nucleosides of the Eupolyphaga sinensis Walker could be preliminarily determined as their quality markers.The study of TCM quality markers provides the basis for the identification of the authenticity,and also provides the theoretical basis for the subsequent development of new dosage forms and the formulation of quality standards.【Key words】 Eupolyphaga; protein; amino acids; fatty acids; alkaloids; blood lipid regulation; anti⁃tumor; quality marker 土鳖虫又名虫,为鳖蠊科昆虫地鳖或冀地鳖的雌虫干燥体,别名地鳖虫㊁土元㊁地乌龟,主产于湖南㊁湖北㊁河南等地,喜昼伏夜出,常生长于温暖潮湿的松土㊂土鳖虫最早记载于‘神农本草经“: 味咸,寒㊂主治心腹寒热洗洗,血积癥瘕,破坚,下血闭,生子大良”,被列为中品,具有散血瘀㊁消坚结㊁解凝活血㊁接骨续筋㊁消肿止痛㊁下乳通经等功效[1],常以生粉入丸散剂使用㊂在我国,冀地鳖㊁金边土鳖㊁中华真地鳖皆可入药㊂现代医药学研究表明,土鳖虫在抗凝血㊁溶解血栓㊁调节血脂等方面具备广泛药理作用,部分医家根据临床经验,发现土鳖虫能治疗慢性胃炎㊁类风湿关节炎等疾病[2]㊂刘昌孝院士针对中药自身医药体系的特征,于2016年提出了中药质量标志物(quality marker, Q⁃Marker)的新概念[3],这一概念具备广泛的科学内涵,因此中药Q⁃Marker的确认对中药的研究发展具有重要意义㊂本文将土鳖虫的化学成分与药理作用进行联系,基于其抗凝血㊁抗血栓㊁调脂降脂㊁抗肿瘤等药理作用,对其有效成分进行分析,并预测其Q⁃Marker,以期为土鳖虫的质量评价体系及产品开发提供科学依据,为后期土鳖虫生粉入药灭菌方式考察奠定理论基础㊂1 土鳖虫所含化学成分的研究进展土鳖虫所含化学成分丰富,主要包括:氨基酸类㊁脂溶性成分㊁生物碱㊁无机元素及核苷类成分㊂土鳖虫中谷氨酸㊁天冬氨酸等含量高,其中赖氨酸㊁苏氨酸为人体必需氨基酸,所含蛋白主要以纤溶活性蛋白为主㊂脂溶性成分包含脂肪酸㊁脂溶性维生素等㊂土鳖虫生物碱可分为氨基酸衍生物类生物碱㊁甾体类生物碱㊁吡嗪类生物碱等㊂除此之外,土鳖虫含镁㊁铁㊁锌等无机元素,尿囊素㊁次黄嘌呤等核苷类成分㊂1.1 土鳖虫所含氨基酸和蛋白质的研究常淮阳等[4]通过对雌雄地鳖的体内成分研究,发现土鳖虫幼虫品质与性别无关,然而成虫体内蛋白质含量差异与性别相关,且雄成虫功能性氨基酸㊁支链氨基酸等含量显著㊂李越等[5]研究发现,温度对土鳖虫体内氨基酸含量影响显著,并表示29℃短时高温作用能使土鳖虫中人体必需游离氨基酸的含量上升㊂以上研究,说明土鳖虫体内氨基酸含量受发育程度㊁外界温度的影响㊂王少平等[6]通过提取土鳖虫总蛋白等成分,并进行体外纤溶活性测定,表明土鳖虫水溶性蛋白的纤溶活性强,推测土鳖虫活血化瘀作用的物质基础是土鳖虫蛋白质㊂研究人员为避免土鳖虫纤溶活性蛋白口服而被上消化道酶降解,因此利用微囊包裹技术,并通过时间/酸碱度依赖发挥结肠靶向效果,从而达到治疗目的,这一创新对土鳖虫新剂型的开发利用具有参考价值[7]㊂1.2 土鳖虫所含脂溶性成分的研究黄莹洁等[8]利用脂质组学方法探究土鳖虫不同炮制品中脂肪油的含量差异,结果表示,土鳖虫不同炮制品的脂质成分有差异,两种炮制品中甘油脂类含量均丰富,固醇脂成分含量最少,仅1个㊂这一研究成果对开发利用土鳖虫炮制品提供了新思路㊂张月等[9]通过亚临界萃取法从土鳖虫中提取出了油脂,通过研究油脂体外抗氧化能力,发现土鳖虫油脂具有显著的清除二苯代苦味肼基自由基能力,并发现地鳖油中含有丰富的维生素E,土鳖虫抗氧化及延缓衰老具体机制仍需深入探究㊂目前,土鳖虫中已经鉴定出了多种化合物,其中包含多种挥发油㊁脂肪酸及脂溶性维生素等营养成分[10],然而,大多数化合物的活性尚不清楚,有待进一步的发掘研究㊂1.3 土鳖虫所含生物碱类成分的研究生物碱是存在于生物体内的一类碱性含氮化合物(除氨基酸㊁肽类㊁维生素等)㊂研究人员采用酸水提取法㊁乙醇提取法对土鳖虫总生物碱分离并纯化,从土鳖虫中提取并测定出氨基酸衍生物类生物碱㊁甾体类生物碱㊁哌啶类生物碱等多种生物碱,另有研究人员在土鳖虫乙酸乙酯提取物中检测出一种新的生物碱[11⁃12],ZHU HJ等[13]从土鳖虫乙醇提取物中,分离得到了5种新的含氮化合物,并根据光谱分析和计算方法,确定了其结构㊂李坤等[14]采用乙醇提取两种土鳖虫中的生物碱,发现不同生源的土鳖虫所含生物碱种类含量有差异,但均具备一定抗菌活性㊂除此之外,土鳖虫总生物碱可提高心肌和脑对缺血的耐受力[15]㊂综上说明土鳖虫生物碱种类多且具备一定药理作用,这对后续土鳖虫生物碱的开发利用具有参考价值㊂1.4 土鳖虫所含无机元素的研究研究表示微量元素对人体健康有益,在治疗和预防疾病方面也有重要作用[16]㊂土鳖虫中含有丰富的锰㊁镁元素,锰作为人体必需的微量元素,对骨骼的生长发育㊁心脑血管等方面有益㊂镁也是机体的重要元素之一,能促进骨生长㊁提高组织供氧能力[11]㊂李养学等[17]采用电感耦合离子体质谱法等测定了不同产地金边地鳖中无机元素的含量,其中铝㊁钙㊁钠㊁镁㊁锌元素含量高,铜㊁砷㊁铅等重金属元素均被检测出㊂左甜甜等[18]对多种动物药进行元素测定,结果发现土鳖虫中铅㊁镉㊁砷等元素的含量合格,符合标准㊂土鳖虫无机元素的测定,对保障土鳖虫入药安全性提供了依据㊂1.5 土鳖虫所含其他成分土鳖虫中核苷类成分包括次黄嘌呤㊁尿嘧啶㊁尿囊素,可采用高效液相色谱法进行定量分析㊂研究表明,土鳖虫多糖能通过酶解法提取,并具备较高抗癌活性[19⁃21]㊂2 土鳖虫及其提取物的药理作用研究进展2.1 抗凝血及调血脂研究2.1.1 与蛋白组学㊁基因组学相关的机制研究 陈龙等[22]通过构造大耳兔逆行岛状皮瓣模型,利用土鳖虫局部给药,发现土鳖虫可缓解皮瓣组织缺氧状况,降低皮瓣组织血液红细胞凝聚,从而防止微血栓的形成㊂WANG Y等[23]从土鳖虫中鉴定出一种双功能抗血栓形成蛋白,该蛋白含有直接作用的纤维蛋白(原)溶解和纤溶酶原激活活性,由此可知土鳖虫具有良好的抗凝血的药效作用,可作为抗血栓的药物㊂张震等[24]通过探究土鳖虫调节血脂的机制,研究与胆固醇代谢相关的基因,发现土鳖虫给药组能明显上调三种基因mRNA表达,推测可能是土鳖虫发挥疗效的机制,具体分子机制有待进一步验证㊂2.1.2 与肠道菌群及代谢相关的机制研究 研究人员通过建立高血脂症大鼠模型,发现土鳖虫生物活性肽具备降低血脂的效果,推测其机制可能与大鼠肠道菌群以及脂质代谢途径相关[25]㊂董萍萍等[26]通过利用土鳖虫活性肽LL8对高血脂症大鼠进行药效学研究,发现LL8具有抑制大鼠肝脏脂肪堆积效果,具备一定调血脂的能力㊂WANG H 等[27]利用离子交换色谱法从土鳖虫中提取得到活性肽AR⁃9,对高脂血症大鼠进行干预,发现活性肽AR⁃9能降低血浆中脂质因子的水平,揭示了AR⁃9作用的潜在机制与改变肠道微生物群及调节代谢相关,这一发现为活性肽AR⁃9的后续研究提供了理论基础㊂姜珊等[28]采用建立高脂血症SD大鼠模型,并利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱和高效液相色谱对土鳖虫活性肽组分进行氨基酸序列分析,结果发现土鳖虫活性肽DP17可降低高血脂症大鼠肝脏血清总胆固醇(serum total cholesterol,TC)㊁甘油三酯(triglyceride,TG)㊁血清低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)水平,并能提升高脂血症大鼠肝内一磷酸腺苷/三磷酸腺苷的含量,进而影响脂质合成㊂大鼠肝脏的脂肪堆积明显被土鳖虫活性肽DP17所抑制,提示其可以调控蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白信号通路以及体内能量代谢平衡来达到降血脂的目的㊂因此,土鳖虫在抗凝血㊁降血脂方面效果显著,详情可见表1㊂这些研究结果提示,土鳖虫活性肽可能是其发挥降血脂功效的关键成分,后期可从转录组学方面,探析土鳖虫发挥药效的作用靶点以及机制㊂表1 土鳖虫活性成分抗凝血㊁降血脂的药理作用及机制表活性成分药理作用模型机制活性肽降血脂高脂血症大鼠下调TG㊁TC㊁LDL水平㊁改善肠道菌群种类活性肽LL8调血脂高血脂症大鼠上调TG㊁TC㊁LDL⁃C水平[26][27]2.2 抗肿瘤研究加强抗肿瘤药物的自主研发,能保障用药需求,确保肿瘤患者的用药安全[29]㊂土鳖虫纯化蛋白具有抗癌效果,也可抑制肝纤维化活性[30]㊂土鳖虫醇提物能抑制前列腺癌细胞的迁移与侵袭[31]㊂另有研究发现,土鳖虫醇提物的抑癌效果或与降低基质金属蛋白酶蛋白表达水平相关[32]㊂土鳖虫70%乙醇提取物可显著抑制A549细胞迁移[33],并且可以通过诱导G2⁃M期细胞周期阻滞和靶向表皮生长因子受体信号通路来抑制人慢性髓系白血病细胞K562的生长[34],土鳖虫血淋巴也能诱导人红白血病HEL细胞凋亡[35]㊂研究发现,土鳖虫提取物能调节丝裂原活化蛋白激酶等信号通路,从而抑制肝癌细胞的增殖和集落形成㊂因此,土鳖虫在抵抗肝癌细胞生长与转移中同样发挥重要疗效,可将其纳入治疗肝癌的有效药物[36]㊂除此之外,国医大师李佃贵[37]利用虫类药具有化瘀㊁通经活络㊁解毒等独特疗效,在临床上常使用土鳖虫等虫类药物来逆转慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生,从而抑制胃癌前病变㊂综上所述,土鳖虫具有明显抗肿瘤功效,并在抑制胃癌㊁肝癌㊁前列腺癌㊁白血病等方面发挥不可或缺的作用,作用机制可见表2㊂2.3 抗炎抗菌研究王继萱团队利用土鳖虫走窜之性,将其用于治疗肝纤维化㊁早期肝硬化㊁慢性肝炎等症[38⁃39]㊂研究表明,土鳖虫可能通过调控肝星状细胞中黏结合蛋白聚糖3的表达,从而使胆碱缺乏诱导的非酒精性脂肪性肝炎得到有效缓解[40]㊂土鳖虫具备显著遏制深静脉血栓形成的作用,其抗血栓机制可能与炎症微环境的改善,即抗炎作用相关[41]㊂土鳖虫发挥抗炎作用的具体有效成分的作用机制尚不明确㊂研究发现,土鳖虫生物碱具有抗炎抗菌的作用,能够抑制大肠杆菌㊁金色葡萄球菌㊁枯草芽孢杆菌的生长,且量效关系显著[14]㊂然而,土鳖虫生物碱抑菌的具体作用机制有待深入研究㊂2.4 增强免疫研究研究人员利用土鳖虫冻干粉作用于环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠,发现土鳖虫冻干粉能下调Bcl⁃2相关X蛋白的表达,上调B淋巴细胞瘤⁃2 (B⁃cell lymphoma⁃2,Bcl⁃2)蛋白表达,显著增强单核巨噬细胞和自然杀伤细胞的功能,即调控先天免疫细胞,提高免疫器官指数,从而有效改善免疫功能[42]㊂2.5 促进骨伤愈合研究人员通过体内实验发现土鳖虫可以促进兔下颌牵张成骨过程中牵张间隙内新生骨的形成,体外实验得出土鳖虫水提物可促进MC3T3⁃E1成骨细胞增殖,具备骨伤愈合的作用[43⁃44]㊂然而土鳖虫发挥骨伤愈合作用的具体有效成分尚不清楚,仍需进一步分析㊂2.6 其他作用中医临证上,方邦江利用土鳖虫攻逐走窜之性,破血通络逐瘀㊁泄浊祛湿功效,将其应用于痛风急性期的治疗[45]㊂周亚滨[46]认为冠心病患者是由于心脉瘀滞等病因,因此可用土鳖虫治疗心脏血积血闭㊁冠心病所致患者血管腔重度狭窄等症㊂陈森林等[47]在应用虫类中药治疗重症肌无力的报道中指出,土鳖虫对于重症肌无力的治疗效果确切,可改善重症肌无力久病不愈所致血瘀气滞㊁肝肾不足等临床表现㊂因此,土鳖虫在临床上治疗急症重症的效果可观,然而治疗机制尚不明确㊂表2 土鳖虫抗肿瘤的药理作用及其机制表成分来源药理作用机制醇提物抗前列腺癌抑制整合素β1的表达从而调节纤维状肌动蛋白重构;抑制PC3细胞迁移与侵袭性半胱氨酸蛋白酶⁃3(cysteinyl aspartate⁃specific proteinase⁃3,Caspase⁃3)蛋白表达㊁促进细胞凋亡;下调基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9表达[32]醇提物抗肺癌下调蛋白激酶B和细胞外信号调节激酶[33]醇提物抗血癌改变细胞周期㊁抑制EGFR磷酸化[34] 孟莹等[48]通过高效液相色谱法㊁体外稳定性实验测定土鳖虫小肽LL⁃8㊁DP⁃17在不同酸碱度㊁温度条件下的稳定性,通过研究小鼠腹腔注射小肽来进行安全性评价㊂结果表明土鳖虫小肽的体外稳定性高,安全性良好㊂另有研究显示,土鳖虫多肽能增强细胞活力,显著提高抗氧化酶活力[49],同时在缓解紫外线辐射所致皮肤光老化方面具备一定成效[50]㊂由此可见,土鳖虫应用范围广,不仅可以用于疾病的治疗,还能作为保健品以及护肤品开发的原料㊂3 中药质量标志物预测分析中药药效物质基础是中药Q⁃Marker及新药研发的关键,不仅能阐述中药作用的核心,还为发现中药Q⁃Marker及制定中药Q⁃Marker提供重要依据[51⁃52]㊂中药Q⁃Marker的价值,在于使药材质量㊁药物成品的质量得到控制,从而保证药物的有效性和安全性,完善中药标准化建设[53]㊂近年来,重点开展的中药Q⁃Marker研究,贯穿于中药制剂研发的全过程[54]㊂依据中药Q⁃Marker,对中药材生粉灭菌工艺进行研究,比较不同灭菌技术对中药Q⁃Marker 及药效影响的基础研究,以及如何在尽量不影响药材生粉质量的前提下灭菌达到相应的限度,为以药材生粉入药的中药制剂提供有效的㊁安全可靠的灭菌方法及工艺参数,对中药制剂的质量控制具有十分重要的指导意义㊂3.1 基于传统功效的Q⁃Marker预测分析土鳖虫性寒㊁味咸,有小毒,入心㊁肝㊁脾三经,具有接骨续筋㊁消散血瘀㊁逐瘀通经等功效㊂土鳖虫活性肽F2组分具有改善血瘀㊁抗凝血及降低血脂的作用[55⁃56]㊂土鳖虫活性肽DP17具有降血脂作用机制[28]㊂土鳖虫水提物具有增加成骨细胞数量,加强骨细胞活性的作用,补骨活血汤中土鳖虫活血止痛效果确切,能缓解疼痛,促进成骨细胞的增殖,因此可治疗骨质疏松㊁膝骨关节炎[57⁃58],也能抑制血小板聚集,延长体外凝血时间[59⁃60]㊂土鳖虫50%乙醇提取物可以促进成骨细胞增殖[61]㊂然而水提物与醇提物中发挥药效的物质基础尚不明确,有待研究㊂土鳖虫活性肽F2组分㊁DP17组分的抗凝血㊁降血脂作用与土鳖虫传统功效 消散血瘀”一致,因此,可将其视为对应药效的物质基础,作为土鳖虫的潜在Q⁃Marker㊂土鳖虫水提物及醇提物增加成骨细胞数目的作用与土鳖虫 接骨续筋”传统药效一致,因此后续可以对土鳖虫水提物及醇提物分离提取纯化,从而挖掘出发挥疗效的中药化学成分,并将这类成分视为土鳖虫潜在Q⁃Marker㊂3.2 基于现代药理的Q⁃Marker预测分析现代研究表明,土鳖虫具有提高免疫㊁抗肿瘤及抗氧化等药理作用㊂土鳖虫多糖可以抑制肉瘤的生长,能显著调节机体的免疫功能,且能通过提高免疫功能来达到抗乙型肝炎目的[62⁃63]㊂除此之外,土鳖虫多糖有明显的体内外抗氧化作用以及抑制癌细胞增殖作用[64⁃65]㊂而土鳖虫纤溶活性蛋白组分具有明显的抑瘤作用[66],土鳖虫醇提物可诱导肿瘤细胞凋亡,抑制癌细胞迁移[67],具备确切抗肿瘤效果[68]㊂尿嘧啶㊁次黄嘌呤等核苷类成分也能发挥抗肿瘤效果[69]㊂土鳖虫中脂肪酸类物质,如油酸㊁棕榈酸㊁油酸丙脂㊁单油酸甘油酯等同样能达到抗癌作用[70]㊂土鳖虫多肽具有提高小鼠肝组织中抗氧化酶活性的作用,也能通过上调肌调节因子(生肌因子5㊁配对盒基因7㊁肌肉转录调节因子㊁人生肌因子6㊁肌球蛋白)的基因表达,影响过氧化氢刺激的小鼠成肌细胞增殖分化能力,从而促进骨骼肌生长[71⁃72],也可缓解肉仔鸡受氧化应激影响下的应激反应[73],具备一定抗氧化能力㊂因此土鳖虫多糖㊁纤溶活性蛋白㊁核苷类成分㊁脂肪酸类成分㊁多肽能作为土鳖虫Q⁃Marker选择的参考依据㊂3.3 基于化学成分可测性的Q⁃Marker预测分析中药Q⁃Marker作为中药的有效成分,需要性质稳定易被检测,同时具备切实可行的检测方法[74]㊂中药所含有的化学成分繁杂且含量差异大,分析物质基础是实现中药Q⁃Marker的关键所在,也是深入研究中药作用机制的重要因素[75]㊂‘中华人民共和国药典“2020年版规定了土鳖虫的杂质㊁水分㊁总灰分㊁酸不溶性成分㊁黄曲霉毒素检查,但并未包含对其主要成分的含量测定方法及主要成分的含量限定要求㊂依据分析,生物碱㊁氨基酸㊁蛋白质㊁核苷酸㊁脂溶性成分及无机元素是土鳖虫Q⁃Marker的重要选择㊂土鳖虫生物碱可采用薄层色谱分析㊁紫外光谱分析㊁红外光谱分析㊁气相色谱分析㊁气相色谱质谱联用分析[11]等方法进行分离测定㊂土鳖虫中钙㊁镁㊁锌等微量元素,可采用火焰原子吸收光谱法[76⁃77]进行测定㊂土鳖虫氨基酸,可采用氨基酸自动分析仪法[78⁃79]㊁高效液相色谱法[80]㊁异硫氰酸苯酯 高效液相色谱柱前衍生化法[81]测定,蛋白质可利用双缩脲试剂法㊁凯氏定氮法㊁紫外吸收法测定㊂土鳖虫多肽可采取SDS⁃SPAGE电泳法进行分子量测定,也可采用超高效液相色谱 质谱联用法测定,蜈蚣㊁地龙等动物类中药亦可用此法进行肽段鉴别[82]㊂核苷类成分可用高效液相色谱法㊁亲水作用色谱法进行测定㊂脂溶性成分中脂肪酸可以运用气相色谱法㊁气相色谱串联质谱法进行含量检测㊂3.4 基于中药配伍的Q⁃Marker预测分析中药具备多种性味功效,常以配伍的形式用于中医临床,因此土鳖虫在不同复方中发挥的药效作用各异㊂名老中医常将土鳖虫与地龙等配伍治疗浊瘀滞留经脉所致关节肿痛,血瘀气滞所导致的胸痹心痛㊂现代医家将土鳖虫与独活㊁蜈蚣㊁独一味配伍,用于治疗脾肾阳虚型痹症;与水蛭配伍,治疗肝肾经络瘀滞所导致的慢性前列腺炎;与黄芪配伍治疗肿瘤;与三七㊁丹参㊁人参配伍治疗气虚血瘀所导致的脑梗;与山茱萸配伍治疗慢性肾衰[2]㊂从处方配伍的角度出发,土鳖虫蛋白的抗肿瘤作用与黄芪等配伍所发挥的疗效一致;土鳖虫蛋白的抗凝血防止血栓形成的功能与地龙㊁蜈蚣等配伍治疗血瘀气滞型痹症作用一致;土鳖虫脂溶成分的抗氧化抗衰作用与山茱萸配伍治疗作用一致㊂综上,基于中药临床应用时有效成分与其功效作用的临床表现,可将土鳖虫中蛋白类㊁脂溶性成分类等作为Q⁃Marker的重点选择对象㊂综上所述,分析土鳖虫的化学成分,可以预测土鳖虫的活性肽㊁多糖㊁纤溶活性蛋白㊁核苷类成分尿嘧啶㊁次黄嘌呤㊁尿囊素㊁脂肪酸类成分㊁生物碱㊁氨基酸㊁多肽可能是其主要药效物质基础,因此能够作为土鳖虫的Q⁃Marker㊂同时应当探寻其药代动力学,分析各类化学成分在生物体内吸收㊁分布㊁代谢等的作用规律,研究药物化学成分入血后的作用机制,建立一个完整的质量测定体系㊂由此可提高质量评价水平,使Q⁃Marker具备更高科学性㊂4 总结与展望土鳖虫用药历史悠久,具备广泛药效作用㊂随着医药行业的不断开阔,土鳖虫用于医疗㊁保健的需求正逐年增加,然而土鳖虫伪品的存在却制约了其合理发展,因此规范土鳖虫的入药标准㊁确保土鳖虫质量刻不容缓㊂目前可采用生物显微镜㊁体式显微镜等仪器进行图片收集,并利用软件合成高清晰度图片进行土鳖虫的性状鉴别,从而快速辨别土鳖虫的真伪[83]㊂除此之外,需建立一套科学的质量评价方法,全面精准地对土鳖虫质量进行评价,保障土鳖虫的资源得到充分应用,确保用药安全,促进土鳖虫药用产业的持续发展㊂中药药效物质基础是探究中药临床疗效的依据,也在中药临床使用方面发挥指导作用㊂本文基于土鳖虫的化学成分及药理作用的研究现状,以中药Q⁃Marker的理论为指导,从三个层面出发,进一步预测出土鳖虫活性肽组分㊁多肽㊁纤溶活性蛋白㊁脂肪酸类成分㊁生物碱㊁核苷类成分可能作为潜在Q⁃Marker,以期为鉴定土鳖虫的真假优劣提供理论支持,也为后续考察土鳖虫生粉入药的灭菌工艺提供依据㊂参考文献[1] ‘图解经典“编辑部.图解神农本草经[M].长春:吉林科学技术出版社,2017:538.[2] 李贺赟,邵蒙苏,张莉莉.土鳖虫的临床应用及其用量探究[J].长春中医药大学学报,2022,38(12):1324⁃1327. 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