重组猪α干扰素的酵母表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用
- 格式:pdf
- 大小:425.88 KB
- 文档页数:7
由表2可以看出,18日龄,实验组A、B禽流感抗体均显著高于对照组,平均抗体滴相差达2个滴度以上,实验组A和B之间无显著差异。
说明人用和鸡用干扰素均可显著提高禽流感疫苗抗体水平。
3 讨论干扰素(IFN)目前是公认的抗病毒的有效药物,且无毒无害、无药物残留。
在治疗人和动物病毒性疾病方面得到了广泛的应用。
经典免疫学理论认为干扰素具有种属特异性,而没有病毒特异性。
但是近期研究表明,这种理论具有一定的局限性。
1995年Tateyama等研究发现猫的干扰素与犬的极为相似,可结合犬细胞表面干扰素受体,从而激活了抗病毒免疫,对犬肿瘤细胞系也有抑制作用[1]。
1997年日本批准重组猫IFN用于治疗犬细小病毒感染,1999年Minagawa的研究进一步确认了重组猫干扰素对犬细小病毒的治疗作用[2]。
2002年Martin V等用Toray公司生产的重组猫干扰素rFeIFN治疗CPV-2病毒感染的犬,治愈率达到66.7%[3]。
2006年,Pedrettia E等研究发现,低剂量的人IFN治疗猫免疫缺陷病,能明显提高试验感染AIDS猫的存活率[4]。
商品化的人干扰素曾经用于治疗狗的淋巴瘤,显示出明显疗效[5]。
徐良玉等1992年研制的牛血IFN对黄犊牛轮状病毒以及感染猪瘟的猪进行试验性治疗,效果良好,对牛总有效率为91.87﹪,猪为58.06﹪[6]。
本研究表明人和鸡的干扰素都可提高肉仔鸡的疫苗接种效果。
关于干扰素的使用剂量与治疗效果的关系,姚清侠等的研究表明,猪α、β、γ对猪口蹄疫病毒、伪狂犬病毒和蓝耳病病毒的抑制作用于干扰素浓度成正比[7]。
陈溥言等研究表明,鸡重组干扰素对新城疫病毒体外抑制率与干扰素的浓度成正比,最低有效量为100IU/ml[8]。
李志忠等在肉仔鸡接种新城疫疫苗前后分别使用100、500100IU/只干扰素调剂免疫反应,取得满意效果[9];吴静等证明口服过量干扰素可能会造成免疫抑制[10]。
本研究表明口服150IU/只干扰素即可发挥干扰素的免疫调节作用。
安进猪药产品水针系列 (3)氟乐欣 (3)强效氟乐健 (3)重症药王 (5)变异血清 (6)蓝圆康泰 (6)高热无敌 (7)混感康 (7)蟾毒抗瘟灵 (8)克敏 (9)喘迪 (10)冰点 (10)特痢特 (11)绝痢 (11)痢安 (12)活力素 (12)一针灵 (13)产后安 (14)附红链 (14)链球康 (15)生血素 (15)口蹄心爽 (16)菌毒一喷净 (17)复方磺胺嘧啶钠 (17)毒痢先锋 (18)磺金甲: (18)炎净: (19)粉针系列 (20)注射液头孢噻呋钠: (20)注射用氨苄西林钠 (21)泰奇菌素 (21)复方阿莫西林 (22)先锋头孢 (22)安进08 (23)注射用青霉素钾 (23)双黄连粉针 (24)安进六百万 (25)金正头孢 (26)中药系列 (26)瘟蓝康 (26)催情旺仔 (27)威尔一号 (27)呼吸道系列 (28)克喘停 (28)咳喘康 (29)安美乐 (29)克喘氟星 (30)预混剂系列 (31)氟康 (31)全能 (31)圆蓝速治 (31)利高全能 (32)附红链消 (33)痢速停 (33)中药/保健系列 (34)胃康灵 (34)增免活性肽 (34)肠景舒 (35)痢痢清 (35)安进维元(畜禽专用) (35)清爽多维 (36)祈强康 (37)霉立克 (37)超浓缩鱼肝油粉 (38)亚硒酸钠维生素E (39)高效蝇蛆净 (39)消毒剂系列 (40)乐利多 (40)蓝色金碘 (40)常规水针系列 (41)柴胡注射液 (41)鱼腥草注射液 (41)板蓝根注射液 (41)硫酸卡那霉素注射液 (42)磺胺嘧啶钠注射液 (42)盐酸左旋咪唑注射液 (42)复合维生素B注射液 (43)维生素B1注射液 (43)维生素C注射液 (44)安乃近注射液 (44)安痛定注射液 (45)水针系列氟乐欣【主要成份】氟苯尼考、多西环素、阿奇霉素、贝尼尔、替米考星、磺胺间甲氧嘧啶钠等【性状】本品为无色或淡黄色的澄明液体。
细胞因子在疫苗中的免疫增强作用罗满林;唐明森;鲁俊鹏【摘要】细胞因子是免疫活性细胞和其它细胞分泌的具有多种生物活性的多肽或蛋白质,这些细胞因子是重要的信息传递物质,特别在免疫、炎症和造血系统等生物学反应过程中具有重要的作用.细胞因子用于重组疫苗上的研究已成为生物学研究中最活跃的领域之一.在基因工程疫苗研制中,常把细胞因子基因(如IL-2、IL-1等)和保护抗原基因连接在一起,构成融合蛋白,以增强疫苗的抗体产生和细胞免疫水平.以干扰素和白细胞介素为例,叙述了细胞因子在免疫增强剂和免疫治疗剂、构建新型基因工程苗等方面的主要研究进展.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2010(044)004【总页数】4页(P55-58)【关键词】细胞因子;疫苗;免疫水平【作者】罗满林;唐明森;鲁俊鹏【作者单位】广东大华农动物保健品股份有限公司,广东新兴527400;华南农业大学兽医学院,广州510642;广东大华农动物保健品股份有限公司,广东新兴527400;广东温氏食品集团研究院,广东新兴527400【正文语种】中文【中图分类】S852.4细胞因子(cytokine)是一类由活化的免疫细胞(淋巴细胞、单核巨噬细胞等)和相关细胞(纤维细胞、内皮细胞等)产生的具有调节细胞功能的高活性、多功能蛋白质多肽分子或糖蛋白,能调节细胞分化增殖和诱导细胞发挥功能,它们通过与高亲和力的特异性受体相互作用,在低浓度下发挥作用,是机体发挥免疫功能不可缺少的成分[1]。
在动物体内,绝大多数细胞因子含量很低,其作用主要是提高动物的免疫功能及与动物的生长和代谢有关。
主要包括干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、转化生长因子(TGF)等。
细胞因子通过旁分泌或自分泌方式发挥生物学作用,它有特定的靶细胞,并通过靶细胞膜上的特异性受体发挥作用。
细胞因子具有免疫调节、抑制肿瘤增殖、促进造血与组织修补和参与炎症反应以及神经内分泌效应等多种生物学功能[2]。
猪伪狂犬病的临床症状、诊断和防治措施作者:张志宽来源:《现代畜牧科技》2017年第01期摘要:猪伪狂犬病是一种急性传染病,是由于感染猪伪狂犬病毒(PRV)而导致。
该病能够导致新生仔猪发生死亡;育肥猪出现呼吸道症状,生长发育缓慢甚至完全停止;妊娠母猪发生流产以及产出死胎;公猪发生不育等,对养猪业造成严重危害。
现对该病的流行病学、临床症状以及防治措施进行介绍。
关键词:猪;伪狂犬病;临床症状;实验室诊断;免疫预防;对症治疗中图分类号:S858.28 文献标识码:B文章编号:2095-9737(2017)01-0136-011临床症状母猪。
通常是生产母猪容易发生,主要症状是发生流产,产出木乃伊胎、死胎,或者推迟分娩,还伴有体温升高,可达到40~41℃,食欲减退,便秘,呼吸困难,眼睛水肿,结膜炎,但基本不会发生死亡。
猪场发生该病后一般能够持续2~3个月,发生流产的几率往往能够达到20%左右,且其产出的后代仔猪的初生重明显不均匀,大部分比较虚弱。
病毒传染给后代仔猪后,通常经过2~3天才出现发病。
哺乳仔猪。
小于3周龄的哺乳仔猪感染病毒后具有最严重的症状。
通常在出生后的2~3天出现发病,体温明显升高,可达到40~42℃,并有大量的泡沫性黏液从口鼻流出,还伴有呕吐、腹泻,发出嘶哑且刺耳的尖叫声,扁桃体发生坏死,眼睑、口角以及颌下发生水肿,在腹股部存在粟粒大小的红色斑点。
行走摇晃,沿着猪圈随意游步,关节逐渐僵直,容易跌倒或者发生瘫痪,呈现间隙性抽搐,全身肌肉明显震颤,通常能够持续大约5min,只要出现以上症状,经过2~3天就会全部死亡。
即使仔猪能够耐过,也会变成僵猪。
断奶仔猪。
通常在断奶后5~7天出现发病,这是由于此时体内母源抗体水平降低,给病毒侵入提供机会。
其临床症状基本上与哺乳仔猪相同,但发病率和死亡率相对较低,且会表现出非常明显的神经症状,如肌肉僵直,全身间歇性肌肉震颤。
另外,病猪体温升高达到大约41℃,发出嘶哑叫声,呕吐,排出黄色稀粪,通常经过2~3天发生死亡。
深度Depth 44猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(PRV)引起的一种接触性传染病。
二十世纪中期流行于东欧与巴尔干半岛各国,在二十世纪六七十年代出现强毒株,席卷北美和西欧各国,随后传入中国,给养猪业造成了巨大的经济损失。
自1947年我国首次报道猪伪狂犬病以来,该病已屡见不鲜。
常引起母猪流产,产死胎、木乃伊胎,导致新生仔猪高热、腹泻、运动失调、呕吐以及神经症状,死亡率极高,可达100%,引起断奶仔猪腹泻、呕吐和神经症状,死亡率可达10%~20%,还会引起种猪的不育症(不发情、配种失败)。
笔者在众多猪场走访服务发现,虽已有相关疫苗和药物等防控技术,但猪伪狂犬病仍处于频发状态,很多猪场遇到猪伪狂犬病,损失惨重。
笔者认为,做好免疫和药物保健,猪伪狂犬病是可控的,可将猪场的损失降到最低。
笔者将近期一例猪伪狂犬病控制案例进行经验分享,希望对业内的朋友有所帮助。
1 发病猪场背景此猪场位于江西省,约1个月前,分两批从江苏省的5个猪场,引进500余头体重约25kg的育肥仔猪。
文 ⊙ 余奎1,计江峰1,张运强1,2*1.湖南加农正和生物技术有限公司2.湖南农业大学动物医学院猪伪狂犬病是养猪业重大疫病之一,持续困扰着业内生产。
2000-2011年,随着相关疫苗、药物和技术的推广使用,猪伪狂犬病得到较好的控制。
近年来,随着相关免疫调节中药的成功研发,猪伪狂犬病的防控愈发便捷高效。
本文就一例发病猪场的救治案例进行经验总结,或对养猪业的朋友们有所借鉴。
一例育肥舍猪伪狂犬病处理案例播;减少各类猪场应激反应,一定要处理好保温和通风的矛盾,为猪群创造适宜的生长环境;减少猪群亚健康,保护好猪只肝脏功能,提高猪群非特异性免疫功能;定期进行猪伪狂犬病疫苗免疫及监测抗体水平,及时淘汰阳性带毒猪。
6.3 猪伪狂犬病净化措施猪伪狂犬病的净化实施方案为:检测→淘汰→分群→免疫→检测→淘汰。
净化方案的实质就是通过gE基因缺失疫苗全面免疫并配合血样检测淘汰野毒抗体为阳性的猪,gE抗体检测即进行伪狂犬病gE抗体的检测,野毒抗体阳性率<15%,一次性淘汰或扑杀净化;野毒抗体阳性率>15%,分步净化;当减少到一定程度时(低于15%),可一次性淘汰净化,最终实现全群猪伪狂犬病的净化。
猪细小病毒病是一种传染病,是由于感染猪细小病毒而导致,主要特征是导致繁殖障碍。
是由猪细小病毒引起的一种猪的繁殖障碍病。
该病具有很高的发病率和感染率,并能够通过污染的饮水、饲料等进行传播。
该病的发生没有明显的季节性,通常在夏、春、秋季节都比较容易浮现发病。
我国不同地区的猪群中都广泛存在该病,对养猪业造成严重影响。
下面我们就一起来看看猪细小病毒病的临床症状猪细小病毒病的防控措施。
1、流行病学病原。
猪细小病毒是引起该病的病原,病毒粒子外观呈圆形或者六角形,衣壳由 32 个壳粒构成,核心存在单股负链 DNA,大约在整个病毒粒子中占到 26.5%。
该病毒能够在猪细胞中无限繁殖,通常原代猪肾细胞比较常见。
只要细胞发生感染就会浮现病变,如裂变、固缩或者变圆等。
该病毒具有非常强的反抗热及消毒药的能力,如其在56℃温度下经过 30 min 热处理依旧无法对其红细胞的凝结能力以及传染性造成明显影响,在70℃温度下也需要经过 2 h 才干够使其感染力降低,在80℃温度下加热 5 min 才干够使其死亡,且其还具有较轻的反抗氯仿和乙醚等溶剂的能力。
流行特点。
目前,已知猪细小病毒的惟一宿主是猪,且任何阶段的家猪和野猪都能够感染该病,其中初产母猪最容易感染。
普通母猪在交配后容易感染病毒,并对胚胎以及新生仔猪造成较大的伤害。
该病通常呈散发或者地方性流行。
同时,由于该病毒具有较强反抗外界环境的能力,从而在被污染环境中能够长期存活,因此猪场只要发生该病,就很难彻底清除病原,从而导致多年连续浮现发病。
2、临床症状在临床上,主要是初产母猪表现出繁殖障碍,而经产母猪、育肥猪、公猪则不会表现出症状。
患病母猪在精神、食欲等方面表现正常,且能够正常发情,但部份尽管能够浮现发情但较难受孕。
在妊娠中期发生感染,有些病猪会表现出腹围缩小,部份发生彻底流产或者足月后产出体型较小的仔猪;部份在产出活仔的同时还会产出不同数量的木乃伊胎;妊娠后期感染该病,部份病猪会产出畸形胎、死胎,往往导致其发生难产而造成死亡或者被淘汰。
猪场发生猪伪狂犬病如何紧急处理?5步走概述:猪伪狂犬病四季都有可能发生,但是根据其病毒特性——寒冷的天气更容易存活。
现在天气在渐渐转凉,如今正是猪伪狂犬病的高发季节。
不同生长周期、品种的猪都有可能患上伪狂犬病。
一旦发现有猪感染伪狂犬病,应第一时间进行紧急控制。
同时,也应做好相应预防措施,避免疫情传播。
猪伪狂犬病紧急处理措施1、立即隔离如果猪场发现疑似得伪狂犬病的猪,要立即隔离,避免猪伪狂犬病疾病的扩散。
特别是仔猪,出现此病发病症状时,要立即处理掉(无害化),可能养猪朋友会很心疼,但是没有办法,以避免造成更大的损失。
2、药物治疗如果确诊是伪狂犬病,先要对发病的猪进行药物治疗。
对感染的病猪,可用(注射或口服)高免血清、抗病毒型干扰素、磺胺间甲、穿心莲、头孢噻呋钠、紫锥菊、黄芪多糖等进行治疗。
(以上药物仅供参考)3、全场消毒隔离病猪后,要立即开展消毒工作。
以上用氢氧化钠等消毒剂喷洒整个猪场;二是将病猪接触过的料槽、草垫等所有东西进行焚烧;三是灭鼠,如果场内有养猫、狗,但不想扑杀,最好要进行病毒检查。
4、全群接种疫苗当确定猪群被猪狂犬病毒感染了,在发现第一例后,要要对所有生猪进行一次伪狂犬病疫苗接种,仔猪喷鼻免疫,成年猪肌注免疫。
如果病情严重,3周后,要再进行一次疫苗接种。
5、尸体、粪便无害化处理在专业机构或者人员的指导下,对病死猪尸体、粪便进行无害化处理,避免病毒扩散,相关车辆和人员要格外注意,及时消毒。
猪伪狂犬病的预防措施紧急处理只是无奈之举,为了把损失降到最低。
而且说实话,目前针对猪伪狂犬病治疗,并没有什么特效药。
所以对于猪狂犬病,除了疫苗接种,日常防御很关键。
猪群中,只有没了猪伪狂犬病病毒,才能有一个无猪伪狂犬病的猪场。
1.消毒伪狂犬病病毒对消毒剂敏感,这意味着经常消毒的猪场得此病的几率会下降。
2.灭鼠有研究表明,除了病猪传播外,老鼠通过自身携带病毒、啃咬生猪以及粪便等,也极容易传播伪狂犬病病毒,所以猪场灭鼠工作很重要。
2012年8月 第4期1~6 甘肃农业大学学报
J0URNAI OF GANSU AGRICUI URAI UNIVERSITY 第4 7卷
双月刊
重组猪 干扰素的酵母表达及其对伪狂犬病毒 的抑制作用
张鲁滨 ,王一成 ,吴润 ,李军星 ,袁秀芳 ,徐丽华 (1.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;2.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江gc#l 310021)
摘要:利用自动发酵罐高效分泌表达rPoIFN a,经硫酸铵沉淀、Q Sepharose FF阴离子交换层析和Superde 200分子筛层析纯化重组猪 干扰素,用纯化的rPolFN~a进行PRV体#bNNi ̄N.结果表明:随着表达时间的延 长,发酵表达液中rPolFN— 含量增高,其中72 h表达液中rPolFN— 的含量可达0.52 g/uI ,约占总蛋白量的 57.5O%o,活性为1.O0×10 U/ I .rPolFN— 提纯液的浓度为7.02/,g/td ,纯度为98.1 ,活性高达1.00×109 U//xI .纯化rPoIFN-a的PRV抑制作用和感染阻断作用的比活均为1.42X10 u/t,g,对PRV增殖抑制作用的比活 为1.42 x 10。U/t*g.表明发酵表达的rPolFN-a对伪狂犬病毒病具有良好的抑制活性,为进一步开展重组猪 干扰 素临床试验提供依据. 关键词:猪a干扰素;巴斯德毕赤酵母;酵母表达;伪狂犬病毒;抑制作用 中图分类号:S 858.28 文献标志码:A 文章编号:1003—4315(2012)04—0001 06
. Expression o±recombinant porcine interferon— in Pichia
pastoris and its inhibition effect on Pseudorabies virus
ZHANG Lu—bin ,WANG Yi—cheng。,WU Run ,LI Jun-xing ,YUAN Xiu—fang ,XU Li—hua (1.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,I.anzhou 730070,China;2.Animal Hushandry
and Veterinary Institute,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China)
Abstract:The recombinant porcine interferon-a(rPolFN—d)was efficiently expressed bv Pichi“past0~ ris in a fermentation reactor and the inhibition of rPolFN— on Pseudorabies virus(PRV)reDlication 钾 vitro was tested after the purification by ammonium sulfate precipitation,Q Sepharose FF chromatographv and gel filtration in turn.The results showed that the concentration of secreted rPoIFN—a in suDernatant reached 0.52>g//,L after 72 hours induction,which accounted for about 57.50 of the tota1 amount of protein and its activity was 1.00×10 U/ I .The purified rPoIFN-d solution contained 7.02 ug/£上L rPoIFN—a with the purity of 98.1 9/6 and the activity of 1.00 X 10。U/ I .The inhibition of the rPoIFN—a on PRV was approximately 1.42×10 U/ug.The blocking effect of the rPoIFN- on PRV infection was aD— proximately 1.42 X 10 U/ug.The replication inhibition effects of the rPolFN—a on PRV was appr0ximate1v 1.42 x 10。U/ug.The conclusion is that the rPofFN- ̄expressed by fermentation has a high inhibition effects on PRV infection in vitro,indicating that the rPolFN a can be used for clinical practice test. Key words:porcine interferon—a;Pichia pastoris;yeast expression;Pseudorabie virus;inhibitiOn effect
第一作者:张鲁滨(1984),男,硕士研究生,主要从事兽医微生物与免疫学研究. mail:1ubin.zhang@yahoo.cn
通信作者:王一成,男,研究员,主要从事动物传染病防治技术研究.E-mail:95711@ i . om
基金项目:浙江省科技计划项目(2010C32087).
收稿日期:2012 03 10;修回日期:2012~05 17 甘 肃 农 业 大 学 学 报 干扰素(interferon,IFN)是由受病毒侵染细胞 所分泌的一种细胞因子,具有抗病毒、抗肿瘤、调节 机体免疫等生物学活性.重组猪a干扰素(recombi— nant porcine interferon-a,rPoIFN—a)是利用基因工 程表达的一种干扰素,具有天然猪a干扰素抗病毒 的广谱性和高效性.Lefevre等[1]、陈涛等l2]、曹瑞兵 等口]先后克隆出猪a干扰素基因,并在大肠杆菌中 成功表达;谢海燕[ 、葛丽等[ 、刘键等[6]成功利用 毕赤酵母表达了rPoIFN 目前rPolFN—a已成为 兽用生物制药领域的研究热点,被广泛应用于抗病 毒研究l7 ]. 伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies vi— rus,PRV)引起的传染病,可致母猪发生流产、死产, 哺乳仔猪表现发热、神经症状和极高的死亡率,可造 成巨大的经济损失.PoIFN—a所具有的可刺激机体 产生抗病毒蛋白质,同时能激活病毒感染细胞相关 基因的表达而使机体迅速处于抗病毒的防御状态的 作用E ],使PoIFN— 可作为有效治疗该病的首选药 物之一.曹瑞兵等l_】lj进行了重组猪l3干扰素对伪狂 犬病毒的体外抑制试验,比活为4.17×10。U/mg; 汤仁树等_】。]证明50 IU/mL rPoIFN-u可抑制 PRV对PK一15致细胞病变效应,但都存在活性偏低 的问题.鉴于此,本研究应用毕赤酵母高效表达 rPoIFN—a,对其进行抑制伪狂犬病毒的体外试验, 以期为进一步的临床试验提供理论依据.
1 材料与方法 1.1菌种、细胞株、病毒 毕赤酵母rPoIFN—a菌株、猴肾细胞(Mare- 145)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV,TCID 。为10 ∞/o.1mL)、伪狂犬病毒 (Pseudorabies virus,PRV,TCID ̄o为1O ・ /o.1H ) 等均由本实验室保存. 1.2培养基和主要试剂 酵母完全培养基(YPD)、诱导培养基(BM— GY)、甲醇诱导培养基(BMMY)按照Invitrogen公 司Multi—copy Pichia Expression Kit配制,蛋白分 子质量标准购自上海升正生物技术有限公司,Tris、 硫酸铵等试剂均为国产分析纯,MEM购自赛默飞 世尔生物化学制品有限公司,胰蛋白酶购自吉诺生
物医药技术有限公司,新生牛血清购自杭州四季青 生物工程材料有限公司. 1.3主要仪器 BioFlo415发酵罐购自美国新布朗什维克科学 公司,pH型精密数显酸度计购自意大利HANNA, 层析仪(AKTA purifier)购自美国通用电气公司, 3110系列水套CO2培养箱购自Thermo Scientific 公司. 1.4毕赤酵母高效表达rPolFN- ̄ 毕赤酵母表达rPoIFN—a参照王朝文等 的方 法并稍作修改.取一80℃保存的毕赤酵母rPoIFN—
a菌株,划线接种于YPD平板,30。C培养2 d,再挑 取单个菌落,接种于5 mI BMGY中,30℃ 220 r/rain摇菌12 h,镜检无杂菌后,全部接种于 400 mL BMGY中,30。C 220 r/rain摇菌24 h,镜检 无杂菌后,将菌液7 000 r/min离心5 rain,弃上清, 菌体用少量BMMY重悬,接种于4 000 mI BMMY 中,使发酵液的酵母菌体浓度D值达到1.发酵表达 条件为:溶氧(Do)35 ,pH6.0,培养温度30。C,搅 拌速度200 ̄950 r/min,通气速率2~25 L/min,氧 气添加速度O ~50 .设定溶氧与搅拌速度、通气 速率、氧气添加速度关联.以30 氨水调节pH,氨 水的补加速度与pH关联.流加甲醇维持诱导表达, 甲醇补加速度与D0关联.分别于表达0、24、48、 72、96、120 h取发酵液样品,离心制备表达上清, SD ̄PAGE检测,Quantity One软件分析蛋白含量 和浓度. 1.5 rPolFN- ̄的纯化 取诱导72 h的表达液,7 000 r/min离心 20 min,获取表达上清,加入硫酸铵至45 饱和度, 沉淀表达上清中的蛋白.用Binding Buffer (0.05 mol/L pH9.0的Tris—HC1)重新溶解蛋白沉 淀,先经Sephadex G-25柱脱盐处理,回收蛋白液上 样于Binding Buffer平衡过的Q Sepharose FF阴离 子交换柱,以0~0.3 mol/L NaC1的0.05 mol/I pH 9.0的TriS—HC1进行梯度洗脱,收集蛋白洗脱 液,再进行Superdex 200分子筛层析,以0.01 mol/L pH 7.2的PBS缓冲液过柱,流速0.2 mL/min,收集rPoIFN—a蛋白峰,进行SDS-PAGE 检测,Quantity One软件分析蛋白含量和纯度.