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PCRDGGE技术样本

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PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳( denatured gradient gel electrophoresis, DGGE) 最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期创造的, 起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。

Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。

后来又发展出其衍生技术, 温度梯度凝胶电泳( TGGE) 。

该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域, 当前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。

双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时, 其迁移行为取决于其分子大小和电荷。

不同长度的DNA片段能够被区分开, 但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样, 因此不能被区分。

DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上, 加入了变性剂( 尿素和甲酰胺) 梯度, 从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。

一个特定的DNA片段有其特有的序列组成, 其序列组成决定了其解链区域和解链行为。

一个几百个碱基正确DNA片段一般有几个解链区域, 每个解链区域有一段连续的碱基组成。

当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时, 该区域这一段连续的碱基对发生解链。

当变性剂那浓度再升高依次达到其它解链区域浓度后, 最高的解链区域也发生解链, 从而双链DNA完全解链。

不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样, 因此其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。

当进行DGGE电泳时, 一开始变性剂浓度比较小, 不能使双链DNA片段最低的解链区域解链, 此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。

然而一旦DNA片段迁移到一特定位置, 其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时, 双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。

部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。

因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度, 因此它们会在胶中不同的位置分开。

然而, 一旦变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域变性剂浓度时, DNA片段会完全解链, 成为单链DNA分子, 此时她们又能在胶中继续迁移。

因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时, 这些片段就不能被区分开来。

在DNA片段的一端加入一段富含GC片段能够解决这个问题。

含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处, 它的解链变性剂浓度很高, 能够防止DNA片段在DGGE胶中完全解链。

当加入GC夹子后, DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能区分开来。

二、实验步骤1.样品预处理2.样品DNA的提取及纯化提取方法根据各样品特点自主选择。

3. PCR扩增 Touchdown PCR method用于DGGE的PCR引物及其扩增程序:（1） V3区的DGGE引物200bp左右的片段正向引物:341F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’); 5` GC-clamp, 有利于检测发生于高熔点区的突变.反向引物:518R (5’－GTATTACCGCGGCTGCTGG－3’)PCR条件:10x PCR buffer 2.5ulMgCl(25mmol/L) 2.5ul2dNTP(10mM/L) 0.5ulforward-pri(10pmol/ul) 0.5ulreverse-pri(10pmol/ul) 0.5ulTemplate DNA 1~2 ulO to 25uladd ddH2PCR程序:94℃ 5min ( Taq added)94℃ 1min65℃ 1min72℃ 1min-------------------------------------------- 20 cycles之后每两个循环降低复性温度1℃--------------------------------------------94℃ 1min55℃ 1min72℃ 1min94℃ 1min55℃ 1min 10 cycles72℃ 1min72℃ 7min（2） V3～V5区的DGGE引物高于500bp的片段①Bacterial正向引物341－357:341F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’);反向引物907－926:907R(5’CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’)PCR程序:94℃ 5min ( Taq added)94℃ 1min65℃ 1min72℃ 1min-------------------------------------------- 20 cycles之后每两个循环降低复性温度1℃--------------------------------------------94℃ 1min55℃ 1min 12 cycles72℃ 3min72℃ 7min②Archara正向引物344－363:ARC344F-GC( 5’- CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGACGGGG YGCAGCAGGCGCGA-3’)反向引物915-934:ARC915R( 5’-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3’)PCR程序:94℃ 5min ( T aq added)94℃ 1min65℃ 1min72℃ 1min-------------------------------------------- 20 cycles之后每两个循环降低复性温度1℃--------------------------------------------94℃ 1min61℃ 1min 12 cycles72℃ 1min72℃ 10min（3） V6～V8区的DGGE引物480bp左右的片段正向引物: 968F( 5’-CGCCGGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTA－3) 反向引物:1401R( 5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’)PCR程序:94℃ 5min ( Taq added)94℃ 1min65℃ 1min72℃ 3min-------------------------------------------- 20 cycles之后每两个循环降低复性温度1℃--------------------------------------------94℃ 1min55℃ 1min 15 cycles72℃ 1min72℃ 10min4.预实验( DGGE 条件优化)DGGE有两种电泳形式: 垂直电泳和水平电泳。

前者是指变性剂梯度或温度梯度的方向和电泳方向垂直; 后者是指两个方向是平行的。

在分析微生物群落的 PCR 扩增产物时, 一般先要用垂直电泳来确定一个大概的变性剂范围。

垂直电泳时, 胶从左到右是变性剂梯度。

在胶的左边, 变性剂浓度或温度低, DNA 片段是双链形式, 因此沿着电泳方向一直迁移。

在胶的另一边, 由于变性剂浓度或温度高, DNA 一进入胶马上就发生部分解链, 因此迁移很慢。

在胶的中间, DNA 片段有不同程度的解链。

在变性剂浓度或温度临界于 DNA 片段最低的解链区域时, DNA 的迁移速率有急剧的变化。

因此, DNA 片段在垂直胶中染色后呈 S 形的曲线, 根据垂直电泳确定的范围, 再用水平电泳来对比分析不同的样品。

5.制胶( 1) 试剂配制① 40% 丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 (Acrylamide/Bis 37.5:1)Ragent amountArylamide 38.96gBis-acrylamide 1.04gO to 100mlAdd ddH2② 10% 过硫酸氨 (Ammonium persulfate)Reagent amountAmmonium persulfate 0.1gAdd ddHO 1.0ml2store at -20℃ for about a week③ 50×TAE BufferReagent AmountTris Base 242g 121gAcetic acid glacial (冰乙酸) 57.1ml 28.55ml0.5M EDTA pH8.0 100ml 50mlO to 1L to 500mlAdd ddH2Store at room temperature④ Denaturant stock solution (8.0%)For 100ml use:0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 40% Acrylamide/Bis (ml) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 2050×TAE Buffer (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2Formamide (ml) 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40Urea (g) 0 4.2 8.4 12.6 16.8 21 25.2 29.4 33.6 37.8 420% 25% 35% 45% 55% 65% 75%40% Acrylamide/Bis (ml) 20 20 20 20 20 20 2050×TAE Buffer (ml) 2 2 2 2 2 2 2Formamide (ml) 0 10 14 18 22 26 30Urea (g) 0 10.5 14.7 18.9 23.1 27.3 31.5( 2) 制胶①高浓度端: Syringe, 高浓度胶70% Denaturant/8.0% gel 10ml 14.5ml 20ml 24ml10% APS 80µl 116µl160µl192µlTEMED 6µl 8.7µl12µl14.4µl②低浓度端: Syringe, 低浓度胶30% Denaturant/8.0% gel 10ml10% APS 80µlTEMED 6µl③上相非变性胶5ml 0% Denaturant/8.0% gel40µl 10% APS3µl TEMED( 3) 制胶步骤按照Bio-Rad 475型梯度生成仪使用说明书操作。

具体操作步骤见视频教程及网上资源( Harvard) 。

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PCR_DGGE技术用于湖泊沉积物中微生物群落结构多样性研究

PCR_DGGE技术用于湖泊沉积物中微生物群落结构多样性研究

第26卷第11期2006年11月生 态 学 报ACT A EC O LOGIC A SI NIC AV ol.26,N o.11N ov.,2006PCR 2D GGE 技术用于湖泊沉积物中微生物群落结构多样性研究赵兴青,杨柳燕3,陈　灿,肖　琳,蒋丽娟,马 ,朱昊巍,于振洋,尹大强(污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京大学环境学院,南京　210093)基金项目:国家“973”资助项目(2002C B412307);国家重大水环境专项资助项目(2002AA601011);国家自然科学基金资助项目(40371102)收稿日期:2006204212;修订日期:2006207212作者简介:赵兴青(1974～),女,江苏高邮人,博士生,主要从事环境微生物生态学.3通讯作者C orresponding author.E -mail :yangly @Found ation item :The project was financially supported by National “973”Project ,China (N o.2002C B412307);National “863”Project ,China (N o.2002AA601011);The National Natural Science F oundation of China (N o.40371102)R eceived d ate :2006204212;Accepted d ate :2006207212Biography :ZHAO X ing 2Qing ,Ph.D.candidate ,mainly engaged in environmental m icrobial ecology.摘要:采用PCR 2DGGE 分子指纹图谱技术比较南京市玄武湖、莫愁湖和太湖不同位置的表层沉积物微生物群落结构,研究结果表明,三湖泊沉积物微生物的16S rDNA 的PCR 扩增结果约为626bp ,为16S rDNA V3～V5区特异性片段。

DGGE操作步骤

DGGE操作步骤

DGGE操作步骤DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis）是一种常用的DNA分析技术，用于研究DNA序列的变异情况和分类等。

DGGE的操作步骤如下：1.准备样品2.PCR扩增将待测DNA进行PCR扩增，以增加DNA的数量。

需要用到一对引物，它们会扩增出感兴趣的DNA片段。

PCR反应体系中含有模板DNA、引物、dNTPs、DNA聚合酶和缓冲液。

引物的选择需要根据研究的目的确定。

3.准备DGGE凝胶将一定比例的聚丙烯酰胺和甲酰胺溶液以一定的比例混合，制备得到DGGE凝胶。

这个比例可以根据需要调整，以获得所需的DNA分离效果。

其中甲酰胺会使凝胶变性，使DNA分子在电泳中以变性形式进行分离。

4.准备DGGE系统将DGGE凝胶置于DGGE装置中。

根据实验需要，在凝胶两端插入电极，接通电源。

将凝胶槽填满电泳缓冲液，用于维持凝胶均匀膨胀，快速散发产热，以及降低电阻。

一般来说，TAE或TBE缓冲液可用于DGGE。

5.准备DNA样品将PCR扩增得到的DNA样品处理成等浓度。

可以用醋酸抽提、酚-氯仿法或商业DNA提取试剂盒等方法进行纯化。

6.电泳分离将等量的DNA样品加入到DGGE样品孔中。

将样品孔上方和下方的空孔填满DNA负载缓冲液，以避免样品在电泳过程中干涸。

开始电泳，一般电泳时间和电场强度要根据平台的规格表决定。

7.停止电泳和染色当DNA样品从顶端到底端通过凝胶后，在适当的时间内停止电泳。

将凝胶取出，根据需要进行染色。

GelRed或者SYBR Green等染料可以用于可视化DNA条带。

8.分析使用相应的软件如Quantity One或ImageJ等，对电泳结果进行分析。

将得到的DGGE电泳图像转化成数值形式，以研究样品中的DNA序列变异情况。

总结：DGGE是一种用于分析DNA序列变异的常用技术。

通过PCR扩增得到的DNA样品，经过一系列处理后，加入到DGGE凝胶中进行电泳分离。

PCR-DGGE实验

PCR-DGGE实验

2 实验流程1.提取DNA并用琼脂糖凝结电泳检验2.用带GC发夹的引物进行PCR，并用琼脂糖凝结电泳检验3.DGGE将长度相同但序列不同的DNA片段分开，并切胶纯化4.用不带GC发夹的引物进行PCR5.连接转化，需要用到感受态细胞6.菌落PCR进行验证2.1 DNA提取用DNA提取试剂盒提取DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检验。

2.2 琼脂糖凝胶电泳将0.3g琼脂糖溶解于30ml的1×TAE缓冲溶液中，加热溶解（微波炉加热或沸水浴加热，至琼脂糖溶解），稍微降温后加入3µL的核酸染料，混匀后倒入托盘中，插入梳子，约半小时后其冷却。

将凝胶放入电解槽中，加样（加有loading buffer的DNA样品），在5V/cm 电压下电泳30min。

在紫外光下观察电泳条带。

2.3 PCR反应及产物纯化采用25µL的反应体系：PCR反应体系成分终浓度引物GC Clamp-F 0.2 μM引物R 0.2 μMM g2+(M g Cl2) 0.5 mMBSA 0.2 mg/lTaq DNA Polymerase 1.25 U10×Taq Buffer 1×dNTP Mixture 0.2 mMDNA模板1~2μldH2O To 25 μl反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45秒，65 ℃复性45秒，72 ℃延伸45秒，共30个循环；72 ℃最终延伸5min。

将PCR产物全部进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下用无菌刀割下含目的DNA片段的琼脂糖块，称重，放入1.5 ml的离心管中，用DNA纯化通用试剂盒纯化PCR产物。

并用紫外分光光度计测定DNA浓度。

2.4 DGGE2.4.1 药品配制：1）40%聚丙烯酰胺丙烯酰胺38.93g双丙烯酰胺 1.07g dH2O To 100ml 2）0%变性剂6%Gel 8%Gel 10%Gel 12%Gel 40%聚丙烯酰胺15ml 20ml 25ml 30ml50×TAE缓冲液2ml 2ml 2ml 2ml dH2O 83ml(to 100) 78ml 73ml 68ml脱气15min，用0.45µm的滤膜过滤。

变性梯度凝胶电泳PCRDGGE

变性梯度凝胶电泳PCRDGGE


04
灌胶前准备好所有需要的东西，试剂、枪头，甚至物 品摆放的位置。
05
制胶是实验的关键，在往玻璃板中灌胶时要匀速地转 动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。
06
灌胶后立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管 子。
DGGE制胶主体部件：
电泳
1
上样的胶孔要用去离子水冲洗干净并吸干。
2
PA G E 胶 装 入 电 泳 支 架 时 注 意 用 去 离 子 水 润 滑橡胶垫。装入后在胶孔中加入缓冲液。
注T意ouPcChRd的own
3 环P境CR，。V3区
产物扩增极 易污染。
细节决定成败！
DGGE分析
DGGE前的准备工作
01
从这一步开始，带上手套。
02
配置试剂时一定要用去离子水，可以配置不同梯度的 变性溶液备用，注意变形溶液中大颗粒的过滤及脱气。
03
制胶洗膜时用的各个容器要用去离子水洗涤干净，以 防止氯离子污染。
3
上样时上样器要深入胶孔底部。
4
尽量在同一个胶上比较所有样品，每一个胶
上要有marker lane。
5
将胶放入电泳槽中时注意正负极。
6
建议低电压电泳一段时间，在样品完全进入
胶中之后再升电压。
剥胶与染色
停止电泳后注意把电泳仪调 零之后在关闭电源
剥胶需要细致，用好去离子 水和保鲜膜。
染色前做好胶样品顺序的标 记。
DGGE图谱的分析
DGGE图谱的聚类分 析、相似性分析
DGGE图谱的主成分分析
DGGE图谱的数字化——Quantity one
DGGE图谱的数字化后的主成分分析
Br+CSM
CSM