水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定 分光光度法-编制说明

壳聚糖的分子量
壳聚糖分子量可采用黏度法、凝胶色谱法和端基法测定.黏度法适合于大分子壳聚糖分子量测定,凝胶色谱法可以测定壳聚糖的重均分子量、数均分子量和分子量分布.端基法只能用于测定壳寡糖数均分子量,
1.重均分子量（Mw）、重均分子量（Weight-average Molecular Weight）：所有合成高分子化合物的分子量以及大多数天然高分子化合物的分子量都是不均一的，它们是分子量不同的同系物的混合物。

定义:聚合物中用不同分子量的分子重量平均的统计平均分子量。

Wi ：相应的分子所占的重量分数。

重均分子量与门尼粘度密切相关，因此常以门尼粘度的高低来显示出弹性体分子量的大小。

测定方法有光散射法、超速离心沉降速度法以及凝胶色谱法等。

mi是分子质量Mi是相对分子质量ni 应该指的是分子数 wi是质量分数
2.数均分子量（Mn）
3.粘度平均分子量( Mv )用Geo rge等人修订的Mark-Houwink公式计算:
[η]= 1. 81×10-3Mv0. 93
4.Z均分子量。

实验一还原糖和总糖含量的测定原理3，5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范实验围内还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系，可用比色测定。

操作简便，快速，杂质干扰较少。

实验方法一葡萄糖标准曲线的制定葡萄糖标准曲线的制定：准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移至100mL容量瓶中，再定容至刻度，摇匀。

浓度为1mg/Ml。

取9支25mm×250mm的试管，分别按下表加入试剂：（ml）项目0 1 2 3 4 5 6 7 8G标液0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 G的量0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 H2O 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 3，5-二硝基水杨酸加入21.5mL蒸馏水,摇匀。

于520nm波长处测A值。

以葡萄糖mg数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

二样品中总糖和还原糖含量的测定以测定山芋中总糖和还原糖含量为例。

1．样品中还原糖的提取：准确称取2g山芋粉，放在100mL烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加工50-60mL蒸馏水，于50o C恒温水浴中保温20分钟，过滤，将滤液收集在100mL 容量瓶中，再定容至100mL。

2．样品中总糖的水解及提取：准确称取1g山芋粉，放在锥形瓶中，加入10mL6mol/L 盐酸，15mL水，在沸水浴中加热半小时，取出一、二滴置于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液检查水解是否完全。

如已水解完全，则不呈蓝色。

冷却后加1滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色，过滤并定容到100mL。

再精确吸取上述溶液10mL于100mL 容量瓶中，定容到刻度，混匀备用。

3．样品中糖含量的测定：取7支队5mm×250mm试管分别按下表加入试剂：加完试剂后，其余操作均与制作标准曲线时相同。

节至中性 , 用7 5 % 甲醇水溶液洗涤 "此方法的特
点是碱用量少 , 操作简单 , 可以制备质量均一的 产品 , 但反应介质较贵 "
2 .3梭 甲基壳聚糖梭化度测定方法
梭 甲基壳聚糖梭化度 , 梭化位置直接影响其
溶解性 ! 乳化性 ! 与金属的鳌合性 ! 吸湿和保湿 性等 "氯乙酸在碱性条件下与壳聚糖的C 6 一 OH 和 CZ 一 N HZ 均可发生取代反应 , 所以最终产物是各种 梭 甲基壳 聚糖的混合物统称N , O 一 梭 甲基壳 聚糖 (C ar boxym et hyl 一 ehi t osan , 简称N ,o 一 e M e ) "关于
. 3 .1电导滴定法 2
称取一定量的N , O一 C M C 溶于蒸馏水中 , 并加
入N aO H 标准溶液 , 转移至 电导池 中通N Z, 在 磁 力 搅拌 下用标 准盐 酸滴 定 同时测 定 电导 率 " 以标 准 盐酸的体 积与电导率作图 " 其梭化度( D S ) 计算式如
下:
D S= A x 0 . 203/ ( l+0 . 022B 一0. 8 OA ) 0
存在(一 C o o N a和一 coo H ) , 此计算式只适 用于梭 甲
基壳聚糖 完全 以R 一 C O O H 形式存在 "
误差 " 另外 , 此方法操作比较繁琐 " 2. . 3离子选择电极法 3
准确称取干燥的c M 一 e h it n 样 品1. i 3 9一 1. 5 9置
3 轻 甲基壳聚糖的应用
接块或戮稠 , 不利于传质进行 , 影响反应效果 " 反应结束后 , 产品是溶液状态 , 不能直接洗涤 , 需要用超滤膜透析除去小分子杂质 , 处理麻烦 "

四、操作步骤
（四）小麦样品中总糖和还原糖的测定 1.取3支试管，编号分别为 1-3 ，按下表向每支试管中加入试剂。 管号
试剂
还原糖抽提液（ml） 总糖抽提液（ml） DNS(ml) 水（ml）
1
0 0 0.5 4.5
2
0.5 0 0.5 4
3
0 0.5 0.5 4
2.将3支试管放入沸水浴中加热煮沸 5min后，冷却。 3.以空白试管（1号管）作对照，于 540nm 波长下，分别测定各管 OD 值并记录。
三、试剂与仪器
（3）3，5—二硝基水杨酸 把 6.3g3，5—二硝基水杨酸溶于 262ml 2 mol/l 的氢氧化钠中将此溶液与500ml 含有 182g 酒石酸钾钠的热水混合，向该溶液中加入 5g 重蒸 酚和 5g 亚硫酸钠，充分搅拌溶解待溶液冷却后， 用水稀释到 1000ml，存储于棕色瓶中。
三、试剂与仪器
（一）仪器
小麦面粉、pH 试纸、容量瓶、玻璃漏斗、移液 管、量筒、试管、沸水浴锅
（二）试剂
（1）6mol/l HCl 和 6mol/l NaOH溶液 （2）1mg/ml葡萄糖溶液 准确称取 80℃烘干恒重的分析纯葡萄糖 0.1g，置于小 烧杯中加入少量蒸馏水溶解后，移到 100ml 容量瓶中，用蒸 馏水定溶至 100ml，混匀，4℃冰箱中保存备用。
二、实验原理
• 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及产物，3 ，5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝 基水杨酸。 • 在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深 浅成正比关系，利用分光光度计在 540nm 波长下 测定光密度值查对标准曲线并计算，便可求出样品 中还原糖和总糖的含量。
3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖

四种糖的测定方法
1. 莫尼酮试剂法（Benedict试剂法）
莫尼酮试剂法是测定还原性糖（如葡萄糖和果糖）的常用方法。

该方法利用莫尼酮试剂中的铜离子与还原性糖发生氧化还原反应，生成红色或黄色的沉淀。

根据沉淀的颜色来定量测定糖的含量。

2.酚硫酸法
酚硫酸法是测定非还原性糖（如蔗糖和乳糖）的一种方法。

该方法利用硫酸和酚的作用来将糖酸化，生成暗红色的化合物。

通过比色法来测定溶液的吸收值，然后通过标准曲线计算出糖的含量。

3.高效液相色谱法（HPLC）
高效液相色谱法是一种精确测定各种糖的含量和成分的方法。

该方法使用高效液相色谱仪来分离糖，并使用UV检测器来检测糖的吸收峰。

根据吸光度与浓度的关系，以及外部标准曲线，可以定量测定糖的含量。

4.旋光法
旋光法是一种测量光学活性糖（如葡萄糖和果糖）的方法。

光学活性糖分子可以使光线在通过时转动其振动平面。

旋光仪可以测量这种旋光现象，并根据旋转角度和样品底物的厚度来计算样品中的糖含量。

以上是四种常见的糖的测定方法。

根据不同的糖类和实验需求，可以选择适合的方法进行测定。

这些方法在食品工业、生化研究等领域起着重要作用，帮助人们更好地了解和利用糖的性质和功能。

第二讲糖的分析方法一、中性糖的测定1．还原糖的次亚碘酸盐定量法适用：各种醛糖；适用于测定淀粉酶解时糖苷键水解的百分率，也可测定淀粉酶产物的寡聚糖链长。

基本反应：CH2OH(CHOH)n CHO+I2+3NaOH→CH2OH(CHOH)nCOONa+2NaI+2H2O (氧化)I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+ NaI (滴定) 2．3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法原理：在碱性溶液中，3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

注意：该法不是化学计量反应，戊糖、已糖和双糖与DNS反应的生色度A500/μmol糖的值分别是：戊糖（木糖、阿拉伯糖）：0.42；已糖（葡萄糖、半乳糖、甘露糖）：0.46；双糖（麦芽糖、乳糖）：0.65。

有人认为还原糖的醛基被氧化为羧基，但当量不准确，不同的糖类产生不等等量的色度，表明它的化学反应是较复杂的。

3．Somogyi-Nelson法还原糖将铜试剂还原成氧化亚铜，在浓硫酸存在下与砷钼酸生成蓝色溶液，在560nm下的光密度与还原糖浓度呈比例关系。

注意：比方法重复性较好，产物稳定，测定范围10-180μg/mL。

4．苯酚-硫酸法苯酚-硫酸试剂可与游离的或寡糖、多糖中的已糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）起显色反应，已糖在490nm处，戊糖及糖醛酸在480nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。

注意：（1）该法颜色持久，较稳定；（2）每种糖的显色值不同，故不宜直接用于杂多糖的定量测定；分析杂多糖时，可根据各种单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。

（3）有颜色的样品，测定值偏高；（4）此法较适于检测凝胶柱部分收集样品中相对糖量的分析。

5．蒽酮-硫酸法糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收，显色与多糖含量呈线性关系。

果蔬中还原糖与总糖的测定果蔬中总糖及还原糖含量的测定一、实验目的1、掌握总糖和还原糖含量的测定方法。

2、学习分光光度计的原理和操作方法。

3、了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理。

二、实验原理总糖是指样品中的还原单糖，在本实验条件下可水解为还原单糖的蔗糖和麦芽糖，以及可部分水解为葡萄糖的淀粉。

多糖为非还原糖，可用酸将没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，再利用还原糖的性质进行测定，这样就可分别求出总糖和还原糖的含量。

糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糖醛，生成的糖醛或羟甲基糖醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糖醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比。

糖类与蒽酮反应生成的有色物质，在可见光区的吸收峰为630nm，可在此波长下进行比色，故可用于糖的定量。

三、实验器材1、材料：梨2.仪器：分光光度计、恒温水浴、电子分析天平、高速冷冻离心机、容量瓶（100ml）×2）玻璃漏斗、量筒、灰浆、锥形瓶、试管、移液管、pH试纸3。

试剂：蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于1000ml体积分数为80%的硫酸中，当日配制使用。

标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：称取100mg葡萄糖，溶于蒸馏水并稀释至1000ml（可加几滴甲苯作防腐剂）。

6mol/lhcl溶液20%氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠固体，溶于蒸馏水中，稀释至100ml。

4、实验操作1、葡萄糖标准曲线的绘制：取6根大试管，从0到5编号，按下表加入每种试剂试剂管号标准葡萄糖溶液/ml蒸馏水/ml蒽酮试剂/mla620nm01.04.00.10.94.00.20.84.00.30.74.00.40.64.00.50.54.0012345置冰水浴中5min煮沸10min，冷却后室温放置10min，在620nm处比色以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/ml）为横坐标做图得标准曲线。

2、样品中还原糖的提取和测定称取1g梨，加入约3ml蒸馏水，在研钵中研磨成匀浆，移入三角瓶中，用约12ml蒸馏水冲洗研钵2~3次，将洗涤液移入三角瓶中。

端羧基测定全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：端羧基测定是一种常用的化学分析方法，用于确定样品中端羧基（carboxyl）基团的含量。

端羧基是一种重要的官能团，存在于许多天然和合成化合物中，包括有机酸、蛋白质、多肽和药物等。

端羧基的测定在许多领域具有重要的应用价值，例如在医药、食品、环境和化工等领域中。

端羧基测定的原理是利用端羧基与某种化学试剂之间的反应来进行定量或半定量的分析。

常用的端羧基测定方法包括氧化-还原滴定法、紫外-可见分光光度法、荧光光谱法、红外光谱法、核磁共振法等。

氧化-还原滴定法是最常用的一种端羧基测定方法，其原理是将待测样品与能氧化端羧基的溴酸溶液反应，生成二碳酸酯，然后用过量的亚硫酸钠溶液滴定未反应的溴酸，从而确定端羧基的含量。

这种方法简单易行，准确性高，适用于大多数样品的测定。

紫外-可见分光光度法是另一种常用的端羧基测定方法，其原理是利用端羧基在特定波长下吸收紫外或可见光的特性来进行测定。

这种方法对于端羧基较强吸光的化合物具有较高的灵敏度和选择性，适用于含有芳香环结构的化合物的测定。

端羧基测定是一种重要的化学分析方法，具有广泛的应用价值。

通过端羧基测定，我们可以准确地确定样品中端羧基的含量，进而对化合物的结构和性质进行分析和鉴定。

在今后的研究和实际应用中，端羧基测定将继续发挥其重要的作用，为各行各业的发展和进步做出贡献。

第二篇示例：端羧基测定是一种用于测定物质中端羧基含量的方法，被广泛应用于化学、生物、医药等领域。

端羧基是一种通过一个碳氧键连接到碳链上的碳氧羰基，是有机物分子中常见的官能团之一。

端羧基在化学反应、生物代谢等过程中都起着重要作用，因此对其准确测定具有重要意义。

端羧基测定的方法有多种，常用的有气相色谱法、高效液相色谱法、红外光谱法、核磁共振法等。

每种方法都有其特点和适用范围，选择合适的方法进行端羧基测定可以获得准确的结果。

气相色谱法是一种常用的端羧基测定方法，其原理是通过气相色谱仪对样品中的化合物进行分离和定量分析。

1.样品中还原糖的提取：称取 5g 左右的平菇，用碾碎装置碾碎，再用研钵研磨，将渣和 汁全部转移到 100ml 的三角瓶中，用水冲洗碾碎装置和研钵，所得液体并入三角瓶中，置于 500C 的恒温水浴中保温 30min， 使还原糖浸出。 10000rpm 离心 2min。 将液体全部转入 100ml 的容量瓶中，用蒸馏水洗涤三角瓶，并转入容量瓶中定容。得到还原糖的待测液。 2. 显色：取三支具有 25ml 刻度的试管，编号，按下表所示的量，精确加入待测液和试 剂。 将各管摇匀， 在沸水浴中加热 5min， 取出冷却到室温， 以蒸馏水定容至 25ml， 混匀后， 在 540nm 波长下，测定各管的消光值。
1
还原糖的测定---3,5-二硝基水杨酸比色法
标准曲线测定结果：
管号 1 0 0 2 10 0.087 3 20 0.263 4 30 0430 5 40 0.598 6 60 0.752 7 80 0.883
葡萄糖含量 （ug） OD 值
葡萄糖标准曲线表
1 0.8 0.6 OD值 0.4 0.2 0 0 -0.2 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 葡萄糖mg y = 0.770x - 0.031 R² = 0.995
管号 还原糖测定液（ml） 蒸馏水（ml） 3,5-二硝基水杨酸试剂（ml） 参比管 0 0 2 1.5 还原糖测定管号 1 2 0 1.5 2 2 0 1.5
还原糖% =
查曲线所得含糖 mg 数 × （提取液总体积/测定时取用体积） 样品 mg 数
× 100
2
总糖的测定----3,5-二硝基水杨酸比色法
1.样品中总糖的提取：称取 5g 左右的平菇，先用碾碎装置碾碎，再用研钵研磨，将渣和
汁全部转移到 100ml 的三角瓶中，用水冲洗碾碎装置和研钵，所得液体并入三角瓶中，加入 20ml 6mol/L 的 HCl 及 30ml 的蒸馏水， 置于沸水浴中保温 1h。 待三角瓶中的水解液冷却后， 用 PH 试纸检测， 以 6mol/L NaOH 中和至中性。 10000rpm 离心 2min。 将液体全部转入 250ml 的容量瓶中，用蒸馏水洗涤三角瓶，并转入容量瓶中定容。得到总糖的待测液。 2.显色： 取三支具有 25ml 刻度的试管， 编号， 按下表所示的量， 精确加入待测液和试剂。 将各管摇匀，在沸水浴中加热 5min，取出冷却到室温，以蒸馏水定容至 25ml，混匀后，在 540nm 波长下，测定各管的消光值。

食品中转化糖（总糖）、还原糖的测定1安全性评估谨防试剂灼伤：加入碱性酒石酸铜甲乙液、20%氢氧化钠和2%盐酸试剂时，需佩戴一次性乳胶手套。

谨防玻璃割伤：使用前检查玻璃仪器外观完好无损，使用时注意轻拿轻放，清洗时，需佩戴防割手套。

谨防高温烫伤：滴定时，调节滴定管滴定速度的手需佩戴涂脂手套/一次性乳胶手套，且不裸露手腕皮肤，双手不碰及电陶炉表面。

2 目的规范食品中转化糖（总糖）、还原糖的检测流程，确保检测结果的准确性。

3 范围适用于各类食品中转化糖（总糖）、还原糖的测定。

4 依据参照GB 5009.7 - 2016食品安全国家标准食品中还原糖的测定、GB 5009.8 - 2016食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定。

5 检测原理还原糖（直接滴定法）：试样经除去蛋白质后，在加热条件下，以亚甲基蓝作指示剂，滴定标定过的碱性酒石酸铜溶液（用葡萄糖标准溶液标定），根据样品液消耗体积计算还原糖含量。

转化糖（总糖）（酸水解-莱茵-埃农氏法）：试样经除去蛋白质后，其中蔗糖经盐酸水解转化为还原糖，再按还原糖测定，根据样品液消耗体积计算转化糖（总糖）含量。

注：①为消除氧化亚铜沉淀对滴定终点观察的干扰，在碱性酒石酸铜乙液中加入少量亚铁氰化钾，使之与Cu2O生成可溶性的无色络合物，而不再析出红色沉淀，其反应如下：Cu2O↓+K4Fe(CN)6+H2O=K2Cu2Fe(CN)6+2KOH②碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。

6 试剂和仪器：实验室三级用水6.1 试剂2 %盐酸溶液，20 %氢氧化钠溶液，碱性酒石酸铜溶液：碱性酒石酸铜甲液（以下简称A 液）（硫酸铜+亚甲基蓝）+碱性酒石酸铜乙液（以下简称B液）（酒石酸钾钠+氢氧化钠+亚铁氰化钾），乙酸锌溶液（219 g/L），亚铁氰化钾溶液（106 g/L），葡萄糖标准溶液。

水溶性壳聚糖脫乙酰度测定方法
1、原理
水溶性壳聚糖在碱性溶液和高浓度的酒精中不溶解，被还原为壳聚糖，按照壳聚糖的脱乙酰度检测方法可检测出水溶性壳聚糖的脱乙酰度。

2、样品处理
取水溶性壳聚糖100g，加入95％的酒精溶液中200ml，搅拌，用1.0 mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液PH值至10－12。

过滤，并反复用酒精冲洗至PH值接近中性。

用定性滤纸过滤得滤饼，烘干滤饼至恒重。

3、脱乙酰度的测定
配制0.1mol/L的HCl标准溶液，0.1mol/L的NaOH标准溶液。

准确称取约0.05克上述干燥至恒重的滤饼，放入干净的50毫升小烧杯中，用移液管移取20毫升0.1mol/L的HCl标准溶液，25℃条件下用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，加2滴0.5％的甲基橙指示剂，用0.1mol/L的NaOH溶液滴定为橙黄色，即为终点。

计算方法：
（M
HCl V
HCl
－ M
NaOH
V
NaOH
）/1000×161
脱乙酰度= --------------------------------×100
W
其中：
W为样品重量（g）
M HCl 、M
NaOH
分别为HCl和NaOH的摩尔浓度
V
HCl 、V
NaOH
分别为HCl和NaOH的用量（ml）
161为壳聚糖的分子量。

壳寡糖比色法色谱法质谱法电泳法引言功能性低聚糖是由2～10个相同或不同的单糖以糖苷键聚合而成，具有糖类某些共同的特性，但不会被胃酸等降解，不在小肠吸收直接到达大肠，具有促进人体双歧杆菌的增殖等生理功能，所以功能性低聚糖又被称为双歧因子。

壳寡糖（chitooligosaccharide，COS）又称低聚葡萄糖胺，低聚氨基葡萄糖等，是功能性低聚糖的一种，是壳聚糖降解后的产物，聚合度一般在2～10之间，是目前自然界中仅知的唯一的碱性寡糖，具有独特的生物活性，如抗菌抑菌；极强的吸湿保湿性；抑制肿瘤细胞（聚合度为6～8时活性最高）；诱发植物的诱导抗病性等，使其在食品、医药、化妆品和农业等方面有广阔的发展前景。

不同分子量的壳寡糖，其生物活性差异很大。

近年来，壳寡糖的功能研究取得了长足的进步，同时也对壳寡糖的分析测定提出了挑战。

文章主要介绍了近10年内壳寡糖的分析测定方法的研究进展。

（一）壳寡糖的分析测定方法研究进展1.比色法在初步分析壳寡糖时多采用比色法。

邬建敏通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)显色，确定了甲壳低聚糖平均聚合度及平均相对分子质量。

刘琳等利用分光光度法测定壳寡糖平均聚合度，此方法经凝胶渗透色谱验证，能较为准确地判断壳寡糖的平均聚合度。

虽然比色法技术简单，对设备要求不高，成本较低，但由于其准确性不高，因此有必要开发一种新的可准确测定壳寡糖的分析方法。

2.色谱法（1）薄层色谱法薄层色谱法是在纸层析法的基础上发展起来的，其分辨效率高，分离效果好，简便易行，重现性好，在同一块薄板上可同时分析多个样品。

孟显丽，陈国华等通过实验建立了薄层色谱（TLC）分析壳寡糖的条件即最佳的展开剂是乙酸乙酯∶乙醇∶水∶氨水= 5∶5∶4∶0.3，样品上行展距为8cm，采用浸渍法显色。

陈小娥，方旭波等通过系统研究，建立了壳低聚糖的薄层-比色分析法，展开剂为正丁醇∶水∶乙酸∶氨水=20∶10∶10∶2；展开温度为25℃，为壳低聚糖的生产和应用提供了一种经济、简便的分析方法。

一、实验目的本实验旨在通过酶解法制备壳寡糖，并对其结构、性质及活性进行初步研究。

二、实验原理壳寡糖是壳聚糖经酶解得到的低分子量多糖，具有多种生物活性。

本实验采用壳聚糖为原料，利用壳聚糖酶对其进行酶解，得到壳寡糖。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）壳聚糖：纯度≥95%，分子量10000-20000；（2）壳聚糖酶：活力≥5000 U/g；（3）其他试剂：NaOH、HCl、蒸馏水等。

2. 实验仪器：（1）恒温恒湿箱；（2）磁力搅拌器；（3）离心机；（4）紫外-可见分光光度计；（5）高效液相色谱仪；（6）凝胶渗透色谱仪。

四、实验方法1. 壳聚糖酶解：（1）称取一定量的壳聚糖，加入适量的蒸馏水，搅拌溶解；（2）将溶液pH调至7.0；（3）加入适量的壳聚糖酶，于50℃、pH 7.0的条件下酶解3小时；（4）酶解结束后，用离心机离心分离，取上清液即为壳寡糖溶液。

2. 壳寡糖纯化：（1）将壳寡糖溶液用乙醇沉淀，离心分离；（2）将沉淀用蒸馏水溶解，再次用乙醇沉淀，离心分离；（3）将沉淀用蒸馏水溶解，冷冻干燥，得到壳寡糖固体。

3. 壳寡糖结构鉴定：（1）红外光谱分析：对壳寡糖进行红外光谱分析，确定其官能团；（2）高效液相色谱分析：对壳寡糖进行高效液相色谱分析，测定其分子量；（3）凝胶渗透色谱分析：对壳寡糖进行凝胶渗透色谱分析，确定其聚合度。

4. 壳寡糖活性测定：（1）抑菌活性测定：采用纸片扩散法，测定壳寡糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等细菌的抑菌活性；（2）抗氧化活性测定：采用DPPH自由基清除法，测定壳寡糖的抗氧化活性。

五、实验结果与分析1. 壳寡糖结构鉴定：（1）红外光谱分析：壳寡糖在红外光谱中呈现典型的多糖特征峰，如C-O伸缩振动峰（1040 cm-1）、C-H伸缩振动峰（2920 cm-1）等，表明其结构中含有糖环、羟基等官能团；（2）高效液相色谱分析：壳寡糖分子量为2000-5000，表明其分子量分布较窄；（3）凝胶渗透色谱分析：壳寡糖聚合度为2-20，表明其聚合度分布较宽。

分光光度法测定纤维素酶酶活1适用范围本方法适用于纤维素酶酶活的测定。

2测定原理纤维素酶在一定温度与pH条件下，水解纤维素分子中糖苷键，生产纤维素寡糖、纤维二糖和葡萄糖，在碱性条件下，3,5-二硝基水杨酸与还原糖发生氧化-还原反应，生产3-氨基-5-硝基水杨酸。

其产生物在煮沸条件下，其颜色深浅与还原糖含量成正比，可用分光光度法测定。

根据吸光度计算其酶活力。

酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解纤维素产生1μg还原糖为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。

3仪器和设备3.1分析天平：精度为0.0001g。

3.2紫外分光光度计。

3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。

3.4PH计：精度为0.01PH单位。

4试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。

4.1柠檬酸缓冲液（pH=5.0）磷酸氢二钠溶液（0.2mol/L）：称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中，定容至100ml。

柠檬酸溶液（0.1mol/L）：称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中，定容至100ml。

取上述配制的磷酸氢二钠溶液24.3ml、柠檬酸溶液25.7ml混匀即为柠檬酸缓冲液，其pH值为5.0。

4.2羧甲基纤维素溶液（CMC溶液）称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200ml水中，于沸水浴中加热至溶解，过滤，取滤液100ml，加柠檬酸缓冲液20ml，蒸馏水40ml，混匀，储存于4℃条件下备用。

4.33,5-二硝基水杨酸显色液（DNS试剂）称取3,5-二硝基水杨酸6.3g加入到约600ml水中，逐渐加入氢氧化钠20.8g，在50℃的水浴中加热搅拌溶解后，再依次加入酒石酸钾钠182g，苯酚5g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000ml，过滤。

滤液储存于棕色瓶中暗处放置7天后使用。

4.4标准葡萄糖溶液（1mg/mL）准确称取105℃烘干至恒重的无水葡萄糖250.000毫克，溶于蒸馏水中，定溶至250ml。

科学研究
本实验方法可为相关科研 工作者提供参考，推动食 品中糖类物质分析方法的 深入研究。
指导生产
为食品生产企业提供技术 支持，帮助其控制产品质 量，满足消费者需求。
实验改进与展望
实验方法优化
进一步优化实验条件，提 高检测方法的灵敏度和准 确性。
扩展应用范围
将本实验方法应用于更多 种类的食品中，扩大其应 用范围。
联用技术
尝试与其他分析技术联用 ，如质谱技术，以提高对 糖类物质的鉴定能力。
06
参考文献
参考文献
书籍名称：《食品化学实验原理与技术》 作者：谢明勇，等
出版时间：2010年
THANKS
感谢观看
04
结果分析
数据记录与处理
数据记录
在测定过程中，应准确记录每个步骤 的数据，包括样品质量、滴定体积、 温度等。
数据处理
对记录的数据进行整理、计算和转换 ，确保数据准确性和可比较性。
结果计算与表示
结果计算
根据实验原理和公式，对数据进行计算，得出还原糖、非还原糖和总糖的含量。
结果表示
将计算结果以表格或图表的形式表示，便于比较和分析。
随着人们对健康饮食的关注度不断提 高，对食品中糖含量的准确测定显得 尤为重要。
实验原理简介
01
本实验采用高效液相色谱法（ HPLC）测定食品中的还原糖、非 还原糖和总糖。
02
通过色谱柱分离不同糖类，利用 示差折光检测器检测，以保留时 间和峰面积进行定性和定量分析 。
02
实验材料与设备
实验材料
食品样品
用于称量样品和试剂。
03
实验步骤
样品处理
样品粉碎
提取
将食品样品粉碎至粉末状，以便于后续的 提取和测定。

（推荐）总糖的测定一、糕点、糖果中还原糖的测定1、直接滴定法1）原理：样品经除去蛋白质后，在加热条件下，直接滴定经标定的碱性酒石酸铜溶液，还原糖将二价铜还原为氧化亚铜。

以亚甲基蓝为指示剂，在终点稍过量的还原糖将蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型亚甲基蓝，根据试样所消耗的体积计算还原糖的含量。

直接滴定法已经过多次改进，只要严格遵守实验条件，分析结果的准确度和重现性是能够满足定量分析的要求。

2）试剂①费林氏剂甲液：称取15g硫酸铜（CuSO4·5H2O）及0.05g四甲基蓝，溶于水中并稀释至1000ml。

②费林氏剂乙液：称取50g酒石酸钾钠及75gNaOH，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000ml，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。

③乙酸锌溶液：称取乙酸锌结晶21.9g，加3ml冰醋酸，加水溶解至100ml。

④106g/l亚铁氰化钾溶液。

⑤葡萄糖标准溶液：准确称取1.0000g经过96±2℃干燥2h的纯葡萄糖，加水溶解后加入5mlHCl,并以水稀释至1000ml。

此溶液每1ml相当于1.0mg葡萄糖。

3）操作方法①样品处理：准确称取样品（粉碎后的）2.5~5.0g置于250ml 容量瓶中，加水50ml，摇匀后慢慢加入5ml乙酸锌溶液，混匀后再慢慢加入5ml亚铁氰化钾溶液，振摇，加水定容并摇匀后静置30min，用干滤纸过滤，弃去初始滤液，过滤液备用。

②标定碱性酒石酸铜溶液：吸取5.00ml碱性酒石酸铜甲液及5.00ml碱性酒石酸铜乙液，置于250ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠3粒，从滴定管加约9ml标准葡萄糖液，使其在2min内加热至沸。

趁热以0.5滴/s的速度继续滴加糖液，直至溶液颜色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖液的体积。

平行操作3次，得m平均消耗葡萄糖液的体积。

计算每10ml(甲、乙各5ml)碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg），即m＝v×c式中m——10ml碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）v——标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积c——葡萄糖标准溶液的浓度（mg/ml）③样品溶液的预测定：吸取费林氏甲、乙液各5ml，置于150ml 三角瓶中，加水10ml、玻璃珠2粒，控制在2min内加热至沸，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管中加样液，趁沸以0.5滴/s的速度继续滴定至蓝色刚好褪去为终点，记录消耗样液的体积。

还原型谷胱甘肽（GSH）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法还原型谷胱甘肽（GSH）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

货号：BC1170规格：50T/48S产品内容：试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体50mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。

标准品：粉剂10mg×1支，4℃避光保存。

产品说明：谷胱甘肽是由谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。

谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。

2-硝基-5-巯基苯甲酸为黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。

自备仪器和用品：分析天平、微量匀浆器（规格2mL）、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计，1mL玻璃比色皿。

一、样品的处理1、组织处理：新鲜组织首先用PBS冲洗2次，然后称取动物组织或者植物组织0.1g。

加入用试剂一润洗过的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）；然后加入1mL试剂一（组织/试剂一比例保持不变即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；8000g4℃离心10min；取上清液放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。

2、血液处理血浆：将收集的抗凝血于4℃，600g离心10分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的试剂一,4℃，8000g离心10分钟,将上清移入新的试管中放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。

血细胞：将收集的抗凝血于4℃，600g离心10分钟，弃去上层血浆用3倍体积的PBS清洗3次（用PBS 重悬血细胞，600g离心10分钟），加入等体积试剂一，混匀后4℃放置10分钟，8000g离心10分钟，吸取上清放于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。