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猪流行性腹泻病毒流行毒株HNLB的分离鉴定

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猪 流 行 性 腹 泻（Porcine Epidemic Diarrhea，PED） 是 由 流 行 性 腹 泻 病 毒 （Porcine Epidemic Diarrhea Virus， PEDV）引起的一种以腹泻、呕吐、脱水、厌食 和极度消瘦为主要特征的高度接触性肠道 传染病 [1, 2]。所有日龄的猪均易感染，且 不同日龄的猪感染后临床症状有明显差别， 成年猪出现轻微腹泻症状，死亡率较低，而 新生仔猪感染后症状较为严重，其感染率和 死亡率高达 80%-100%[3]。PED 给我国养猪 业带来了巨大的经济损失，成为目前亟待解 决的一大难题。
Isolation and Identification of Porcine Epidemic Diarrhea Virus HNLB Strain Abstract: In this study, the pig intestinal tract and its contents collected from a suspected PEDV infected in a pig farm in Henan were treated and inoculated into Vero cells and subjected to continuous in vitro subculture. The strain was successfully isolated and identified in vitro by S gene genetic evolution analysis, RT-PCR and indirect immunofluorescence assay, and named as PEDV HNLB. The strain was able to stably pass on Vero cells and produce typical cytopathic effects (CPEs) with a 6th generation virus titer of 104.3 TCID50/mL. The successful isolation of the HNLB strain laid the foundation for the development of a new and effective PEDV vaccine in the future. Key words: Porcine epidemic diarrhea virus; Isolation and Identification; Vaccine
PED 于 1971 年首次在英国被报导，但 并未从感染猪只中分离出猪流行性腹泻病 毒 [2]。1978 年，比利时暴发 PED 疫情并从 发病猪肠道内容物中分离出了 PEDV CV777 毒株 [6]。1973 年我国首次报道了 PED 疫 情，随后证实其病原为 PEDV。宣华等首次用 猪胚胎肠单层细胞成功培养 PEDV 并通过 荧光抗体染色试验和中和试验证实 [7]。
X 畜禽防治 2019 年 6 月·下
猪流行性腹泻病毒流行毒株 HNLB 的分离鉴定
蔡芳玲 焦国莲 杨进才 （中农威特生物科技股份有限公司，甘肃 兰州 730046）
摘 要 本研究将采集自河南某猪场的疑似感染 PEDV 的猪肠道及其内容物处理后接种于 Vero 细胞并进行连续体外传代培养。经过 S 基因遗传进化分析、 RT-PCR 和间接免疫荧光试验等成功在体外分离鉴定了该毒株，并命名为 PEDV HNLB。该毒株能够在 Vero 细胞上稳定传代并产生典型的细胞病变效 应（CPEs），其第 6 代的病毒滴度达到 104.3TCID50/mL。HNLB 毒株的成功分离为今后研制新型、有效的 PEDV 疫苗奠定了基础。 关键词 猪流行性腹泻病毒；毒株分离鉴定；疫苗
此后，PED 在我国以零星小规模发生为特 征。2010 年 10 月，一种不同于欧洲经典毒 株 CV777 的高致病性变异毒株在我国流行， 导致 PED 在全国范围内显著增加并迅速蔓 延，引起有史以来最严重的 PED 疫情。随后， 在亚洲、欧洲、美洲等大部分国家和地区也 都暴发了由高致病性变异毒株引起的较大 规模的 PED 疫情。近年来，我国当前 PED 疫 情较为严重，阳性率居高不下，给养猪业的 疾病防控带来了严峻的挑战。本研究从河南 灵宝采集到病料中分离到了 PEDV 毒株并对 其遗传性状、免疫原性和生物学特性进行研 究，以期为 PEDV 的致病机理研究和疫苗研 制提供科学依据。
1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 病料和细胞 病料样本采集自 2017 年河南灵宝某猪 场疑似腹泻仔猪的肠道及内容物。Vero 细 胞由实验室冷冻保存。 1.1.2 主要试剂 PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase 和 DNA ladder Marker 购自宝生物工程（大 连）有限公司； DMEM（1×）、Anti-Anti （100×）、PBS（1×）、胎牛血清（FBS）、 0.25% Trypsin-EDTA（1×） 购 自 Gibco 公 司。QIAquick® Gel Extraction Kit 和 RNeasy® Mini Kit 提 取 试 剂 盒 来 自 Qiagen 公 司； solution（TPB） 购 自 Sigma；AMV 反转录试剂盒购自 Promega 公 司（美国）；PEDV 抗 N 蛋白单克隆抗体由 清弘生物科技有限公司制备。 1.2 方法
PEDV 属 于 尼 多 病 毒 目、冠 状 病 毒 科、 α- 冠状病毒属成员，病毒粒子形态呈球 形，有囊膜似皇冠状 [4]。病毒核酸为不分 节段的、线性、单股正链 RNA 病毒。PEDV 基 因组全长约为 28-30 Kb[5]，由 5´ 非编码 区（UTR）、七个开放阅读框（ORFs）和 3´ 非编码区（UTR）组成。病毒基因组结构为 5´- 复 制 酶（1a/1b）-S-ORF3-E-M-N-3´。 5´ 端有帽子结构，3´ 端有 polyA 尾巴结构。 七个 ORFs 编码三种非结构蛋白，即 ORF1a、 ORF1b 和 ORF3，以及四种结构蛋白，分别为 纤突糖蛋白（S）、小分子膜蛋白（E）、膜 糖蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。

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2株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及ORF3基因的克隆与序列分析

2株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及ORF3基因的克隆与序列分析

2株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及ORF3基因的克隆与序列分析张小峰;涂玉蓉【期刊名称】《养猪》【年(卷),期】2014(000)003【摘要】For the study,prevention and control of Guangdong area of porcine epidemic diarrhea,this experiment first by determining the presence of porcine epidemic diarrhea virus in swine fecal samples of RT-PCR method, followed by the use of Vero cells were blind transfer,the nucleic acid identification of virus,RT-PCR,TCID50 de-termination,gene sequencing and sequence analysis method,to confirm separation 2 strains of porcine epidemic diarrhea virus strains,named as PEDV GDKP-2013 and PEDV GDKP2-2013,through ORF3 gene nucleotide se-quence analysis,consistency of the amino acid sequence of GDKP-2013 strain and GDKP2-2013 strain and clas-sic reference strain JX261936-CHGD-01,98.2%,98%; JQ039903-CH-GD-2011,98.6%,98.4%;AF353511-CV777,95.4%,95.1%;KC344845-STPED0810,95.1%,94.8%;EU054929-DR13,95.5%,95.2%;KF272920-USA-Colorado-2013,95.1%,94.8%,showed that the 2 strains of virus,and domestic isolates of amino acid homology, with South Korea,Thailand and American isolates of amino acid homology is lower,and amino acids,homologous vaccine reference strains is relatively low;analysis of gene system evolution,GDKP-2013 strain and GDKP2-2013strain were mainly in the branches and attenuated vaccine strain (b branch) between genetic evolution relation-ship is far.%为研究、防控广东地区猪流行性腹泻，首先通过RT-PCR法确定某猪场粪便样品中存在猪流行性腹泻病毒，随后利用Vero细胞进行盲传，最后经核酸类型鉴定、RT-PCR、病毒TCID50的测定、目的基因测序和序列分析等方法，确认分离到2株猪流行性腹泻病毒毒株，命名为PEDV GDKP-2013和PEDV GDKP2-2013，通过ORF3全基因核苷酸序列分析可知，GDKP-2013株与GDKP2-2013株与经典参考毒株的氨基酸序列一致性为 JX261936-CHGD-01，98.2%，98%；JQ039903-CH-GD-2011，98.6%，98.4%；AF353511-CV777，95.4%，95.1%；KC344845-STPED0810，95.1%，94.8%；EU054929-DR13，95.5%，95.2%；KF272920-USA-Colorado-2013，95.1%，94.8%，表明此2毒株与国内分离株的氨基酸同源性高，与韩国、泰国和美国分离株的氨基酸同源性要低一些，同时，与疫苗参考株的氨基酸同源性也相对较低；基因系统进化分析可知，GDKP-2013株与GDKP2-2013株主要处在Ⅰa分支，均与弱毒疫苗株（Ⅰb分支）相互之间遗传进化关系较远。

我国猪流行性腹泻流行现状分析及变异毒株鉴别检测方法研究进展

我国猪流行性腹泻流行现状分析及变异毒株鉴别检测方法研究进展

收 稿 日期 ： ２ ０ １ ７ — ０ ６ — ２ ９
ｌ １ ８
养猪 Ｓ ＷＩ Ｎ Ｅ Ｐ ＲＯ Ｄ Ｕ Ｃ Ｔ Ｉ Ｏ Ｎ（ ４ ）
２ ０ １ ７
染 率 一 直 居 高 不 下 ，区 域 性 流 行 特 点 显 著 ， 如 ２ ０ １ ２ －２ ０ １ ３年 四 川 的感 染 率 高 达 ８ ６ ． ６ ７ ％， ２ ０ １ ４ ＿ ＿ ２ ０ １ ５年 山西 的感 染 率达 ７ ３ ． ２ ６ ％， ２ ０ １ ５ －２ ０ １ ６年 黑 龙江 、 吉林 、 辽宁等 ３省 的感染 率达 ７ ４ ． ６ ２ ％。Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ 在我 国猪群 中 已广泛 流行 ， 且 在个别 地区感染 率较 高， 感染情况 比较严峻 ， 应加强重视 。
表２ ２ Ｏ １ Ｏ 一２ 叭７年 Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ流行 病学监 测情 况汇总
２ ０ １ ０ —２ 叭３
２ ０ １ ｌ 一２ ０ ｌ ２
析 。结 果显 示 ， ９株 Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ Ｓ基 因核 苷酸 同源 性 为 ９ ８ ． ４ ％～ ９ ９ ． ５ ％， 与疫苗株和 中 国 ２ ０ １ ０年前 经典毒株 相 比核苷 酸 同源 性为 ９ ３ ． ４ ％～ ９ ６ ． ２ ％， 与中 国、 韩 国、 美国近年来暴发 的毒 株相 比核苷酸 同源性 为 ９ ７ ． ４ ％ ９ ９ ． ２ ％， 现 阶段 Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ Ｓ基因 已发生较大变异 ， 存在 高度 相似的缺失 ， 插入和变异 ， 且在中和表位区域存 在多处变异 。遗传进化树显示 ，我国常用的疫苗毒 株Ｃ Ｖ ７ ７ ７处于 Ｇ １ 组， 这 ９ 株 毒株 Ｓ基 因均位 于 Ｇ ２ 组， 说 明我 国当前 流行毒株 与疫苗株和 早期经 典毒 株 的亲缘性相去较远 。表 明我 国 Ｐ Ｅ Ｄ Ｖ流行毒株 以
规模化猪场仔猪黄白痢大肠杆菌的分离鉴定

规模化猪场仔猪黄白痢大肠杆菌的分离鉴定

规模化猪场仔猪黄白痢大肠杆菌的分离鉴定规模化猪场仔猪黄白痢大肠杆菌的分离鉴定仔猪黄白痢又称新生仔猪腹泻，是仔猪黄痢和白痢的总称，很大一部分是由致病性大肠杆菌引起的一种高致病性的传染病，以排出白色或黄色稀粪和迅速死亡为特征。

由于大肠杆菌血清型众多，且不同年龄的猪感染大肠埃希菌的主要血清型不同，因而疫苗的使用保护性差，且由于耐药性的产生，都给本病的防治造成一定的难度。

本试验对某猪场发生仔猪黄白痢的病原菌进行分离鉴定，旨在为该养猪场制定有效的防制措施提供依据。

1材料与方法1．1病料与试剂来源于镇江地区某规模化猪场11窝30日龄内发生黄白痢的仔猪，用灭菌棉拭子从腹泻仔猪直肠采集粪便55份，进行细菌的分离鉴定。

营养肉汤、营养琼脂、麦康凯琼脂、SS培养基、三糖铁培养基；生化鉴定培养基购自杭州天和微生物试剂公司；药敏纸片购自杭州天和微生物试剂公司；大肠杆菌O抗原定型血清购自中国兽医药品卫生监察所。

1．2试验动物体重20-25 g健康小白鼠90只，雌雄各半，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。

1．3细菌分离中国猪网网友建议用棉拭子采集发生黄白痢的仔猪的肛门粪便，混悬于装有灭菌生理盐水的灭菌离心管中，摇动离心管彻底洗涤拭子粪便于管中，并靠壁旋动拭子，挤出液体。

用接种环取上述大便悬液1—3环，接种于麦康凯琼脂培养基平板，置37℃培养24 h后观察培养特性。

将以上麦康凯培养基中的红色菌落，再接种于SS培养基、麦康凯培养基中，置37℃培养24 h后进行纯化培养，观察菌落的生长情况，并取麦康凯培养基上的单个菌落进行涂片，革兰氏染色、镜检。

1．4生化特性试验按文献方法进行。

取纯培养细菌接种于营养肉汤中，37℃培养24 h后，接种到各微量发酵管及种生化培养基中，置37℃培养24 h后，观察记录结果。

1．5致病性试验将接种细菌后的营养肉汤37℃培养24 h后，分别腹腔接种体重20 g左右的小白鼠，每株接种10只，每只0．2 mL(含菌量约为8．0×108CFU／mL)，同时用10只小白鼠接种无菌肉汤作对照。

猪流行性腹泻的诊断与防治措施

猪流行性腹泻的诊断与防治措施

猪流行性腹泻的诊断与防治措施猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是一种由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的猪只消化道疾病，临床症状为急性腹泻，发病率和死亡率较高。

对于猪产业来说，PED的发生会给生产和经济带来严重损失。

因此，对PED的诊断与防治非常重要。

一、PED的诊断：1.临床症状：PED的临床症状主要表现为猪只急性腹泻，粪便量多且质地稀水，粪便颜色变浅，有时甚至出现黄色水样便。

猪只全身状况差，食欲减退，体重下降，甚至出现死亡。

2.实验室检测：通过实验室检测，可以确定PEDV是否存在于猪只体内。

常用的检测方法包括：-RT-PCR法：通过提取样本（如猪粪）中的RNA，使用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测PEDV的存在。

-病毒分离：将猪只样本接种到特定细胞株中，观察是否能够分离出PEDV。

-免疫组化（IHC）：通过免疫组化技术检测PEDV的抗原存在，可以在组织切片中进行观察。

二、PED的防治措施：1.强化生物安全措施：加强猪场的生物安全措施是防治PED的一项重要措施。

包括加强猪舍的清洁消毒，限制人员进出，妥善处理猪粪等。

2.隔离和检疫措施：尽早发现疑似病例，并隔离感染猪只，避免PED 的扩散。

对于新引进的猪只，应进行检疫，确保不携带PEDV。

3.完善疫苗接种计划：疫苗是预防PED的有效方式之一、针对PEDV 研发的疫苗已经问世，并广泛应用于猪场。

养殖户应在兽医的指导下，制定合理的疫苗接种计划，加强对猪只的免疫保护。

4.饲养管理措施：加强猪只的饲养管理，包括提供优质饲料和饮水，保持猪舍的适宜温度和湿度，增强猪只的免疫力。

5.健康监测和报告：实施定期的健康监测，及时发现和报告PED的疫情，以便进行及时防控。

总之，PED的诊断与防治是针对该疾病的重要措施。

通过临床症状观察、实验室检测等手段，可以确诊PED。