黄酮提取实验方案
1材料与仪器
1.1 材料
1.2 试剂
芦丁，无水乙醇，氢氧化钠,石油醚，硝酸铝，三氯化铁，三氯化铝，浓氨水，浓盐酸，镁粉，亚硝酸钠（以上均为国产分析纯），实验所用水均为蒸馏水。
1.3 实验仪器
电热恒温水浴锅
电子天平（感量0.0001g）
722型光栅分光光度计
索氏提取器
量筒（100ml,10ml）25ml比色管移液管小试管白瓷板圆底烧瓶 100m容量瓶锥形瓶
2 实验原理
2.1 提取原理
2.2 分离方法及原理
3 实验部分
3.1原料的预处理
金星科厥类叶→除杂→水洗→晾干→粉碎
3.2 芦丁—标准溶液的配制
将芦丁在干燥箱里用120℃条件下恒重1.5h,然后精确称取芦丁标准品0.01g用85%的乙醇溶液配制成100.00mL的溶液，备用。
3.3 测定波长的选择
精确移取芦丁标准溶液0.50mL,置于25.00mL的比色管中，用质量分数为85%的乙醇稀释到10.00mL处，加人5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加入4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min,加入85%的乙醇溶液至刻度，摇匀，10min后在460～560nm处测定吸光度,[4]（以试剂样品做空白）选择最大吸收波长。
3.4 芦丁标准曲线的绘制
精确吸取芦丁标准溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL于6支25.00mL的比色管中，用质量分数为85%的乙醇稀释到10.00mL处，加人5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加入4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min，加入85%的乙醇溶液至刻度，摇匀，10min后于波长500nm处测定吸光度，（以第一瓶为空白溶液）然后以吸光度和芦丁溶液浓度做图，绘制标准曲线。
3.5 黄酮类化合物的特征性实验[5]-[6]
在一定条件下对提取的黄酮类化合物进行特征性实验，具体内容如下：
（1）盐酸—镁粉反应：取1.00mL提取液于试管中加适量镁粉摇匀，再加入浓盐酸数滴（1次加入），观察其泡沫颜色。（2）三氯化铝反应：取提取液点在滤纸上，滴加1%三氯化铝乙醇溶液，吹干，观察颜色变化。（3）三氯化铁反应：取几滴提取液于白瓷板上，滴加1%三氯化铁乙醇溶液，观察其颜色。（4）浓氨水反应：取乙醇提取液点在滤纸上，将滤纸在浓氨水上方熏0.5min，观察其颜色变化。
3.6 单因素实验
2.6.1 较佳提取剂质量分数的确定
准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用无水乙醇、95%、85% 80%、75% 的乙醇60mL对3g金星厥科叶样品在水浴温度为80℃下回流提取3h.提取完毕，用与提取剂的质量分数相同的乙醇反复洗涤圆底烧瓶、滤纸包，将其定容于100:00mL容量瓶中，然后精确吸取0.50mL提取液置于25.00mL的比色管中，用与提取剂质量分数相同的乙醇稀释到10.00mL处，加人5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加入4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min,加入85%的乙醇溶液至刻度，摇匀，10min后于波长500nm处测定其吸光度，同时做三组平行实验。
2.6.2 较佳提取时间的确定
准确称取3g 处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用2h 、2.5h 、3h 、3.5h 提取时
间用60mL 、85%的乙醇对3g 金星厥科叶样品在水浴温度为80℃下回流提取，乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。
2.6.3 较佳提取温度的确定
称取3g 处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别在75℃、 80℃、85℃、 90℃的水
浴温度下用60mL 、85%的乙醇对3g 金星厥科叶样品回流提取2.5h ，乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。
2.6.4较佳物料比的确定
称取3g 处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用30mL 、45mL 、60mL 、75mL 、90mL
的85%的乙醇溶液在水浴温度为85℃下对3g 金星厥科叶样品回流提取2.5h ，乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。
3.7 叶绿素对黄酮类物质的影响
称取15g 金星厥科叶样品放于锥形瓶中用90mL 的石油醚浸泡8个小时对其脱色，过滤、干燥。然后准确称取处理过的3g 金星厥科叶样品用质量分数为85%的60mL 乙醇溶液在水浴温度为85℃下对其回流提取2.5h ，乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。
3.8 金星厥科叶中黄酮类化合物含量的测定
精密量取石油醚处理过的提取液0.50mL ，置于25.00mL 的比色管中。加85%的乙醇稀释到
10.00mL,加入5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min,再加入4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min ，加入85%的乙醇溶液至刻度，摇匀，10min 后于波长500nm 处测定吸光度。
同时做样品空白管.根据标准曲线计算提取物中黄酮类化合物的含量.(把样品所测得吸光度的
平均值代入标准曲线方程,再算出0.50mL 提取液中黄酮类化合物的浓度,然后再根据浓度算出样品中黄酮类化合物的百分含量.)计算方法(公式)如下：
设样品中黄酮类化合物的含量为 ,稀释以后的浓度为C;原提取液的浓度为C0 ;
4 结果与讨论
4.1 最大吸收波长的选择
将定量的黄酮提取液显色以后在460～560nm 处测定吸光度,（以试剂样品做空白）选择最大吸收波长，测定结果如下：
%1001000000.3100⨯=⨯⨯g ml
Co x Vo
V C Co ⨯=
