感受态细胞的制备

一、电转化感受态细胞的制备1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。

（同时做培养基和枪头的空白对照）2.37℃，220rpm，培养14-16个小时。

3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rp m，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。

4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm 离心10分钟。

5.弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm 离心10分钟。

6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。

7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。

8.弃上清，每个离心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1. 5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。

同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。

9. 次日观察转化子生长情况，并记录。

二、连接产物纯化1．将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂:10μl of ddH2O2μl of 3M NaAC（PH5.2）50μl of 无水乙醇轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上；2.4℃，top Speed 离心30分钟；3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；4.加入500μl70%的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）；5.4℃，top Speed离心5分钟；6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味；7.加入10μlddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用；三、电转化1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2.取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。

3.将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10mi n。

4.打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。

5.将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；6.将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl 的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。

7．37℃，220－250rpm复苏1小时。

8. 取20μl转化产物加160μlSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。

其余菌液加1：1的30%的甘油后混匀－80℃保存。

注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。

四、电击杯清洗流程1.用清水将电击杯稍冲一下。

2.向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。

3.弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。

4.加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。

5.弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。

6.将清洗好的电击杯放入-20 ℃冰箱内待用。

注：1．不同样品使用的电机杯应分开；2．每周用1%酒精浸泡30分钟。

各位虫友好，想请教下大肠杆菌电转化方面的一些问题，希望各位虫友多多指教 .最近一直在做电转化，可每次制备的电转化感受态细胞都不行，最开始做的还可以达到10的六次方，可最近两次做的，貌似做好的电转化感受态细胞里面的菌体全都死了？是为什么呢？有人有遇到这种情况的吗？还望各位网友多多指教，1楼: Originally posted by clx@6016 at 2011-11-21 1134:各位虫友好，想请教下大肠杆菌电转化方面的一些问题，希望各位虫友多多指教 .最近一直在做电转化，可每次制备的电转化感受态细胞都不行，最开始做的还可以达到10的六次方，可最近两次做的，貌似做好的电转化感受态 ...先把新鲜划好的菌接到含有Amp的3mlSOB试管中，30度过夜培养，第二天以1:50的接种量转接到50ml含有Amp的SOB中(转接之前加入MgCl2)，30度摇菌2小时，OD600为0.1左右，然后加入L-阿拉伯糖诱导35分钟，OD600为0.3-0.4左右。

5000转，4度离心10分钟，收菌。

然后用10%甘油重悬3次，5000转，4度离心10分钟。

最后将菌体浓缩500到800倍后保存在10%甘油中。

然后立刻电转！如果有什么问题，还请各位前辈多多指教哈！3楼: Originally posted by chenchuan24891 at 2011-11-27 0956:你应该自己好好去按文献的方法检查一下，大多数情况下是自己的失误造成的。

如果还是这样的话，请你把你做的步骤给大家看一下。

protocol和建议电转条件大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备发布时间：2011年03月07日点击次数：：次3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。

为避免电击时出现“击穿”，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。

转化效率为109～1010转化子/µg DNA。

3.1．感受态细胞的制备（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。

（2）选合适的大肠杆菌在4℃，3000 rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存1～2天）。

（3）弃上清，离心管中加入少量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000 rpm离心10min。

（4）重复步骤（3）1次。

（5）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000 rpm离心10min。

（6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。

（7）按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。

3.2．电转化为了降低离子浓度，待转化的质粒DNA，如质粒或酶连产物，在电转化前应该进行纯化（乙醇沉淀），以下所有步骤都需要保持无菌操作。

（1）从－80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；加入待转化的质粒DNA，冰浴10min；同时将电转化杯进行冰浴。

实际操作中，如果电转化杯浸泡在乙醇中，可提前取出电转化杯，在无菌的超净台上吹干。

（2）打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。

特别注意，不同的电转化杯，所使用的电压不同。

防止电压不够，难以有效转化，以及，电压过高，击爆电转化杯，产生火花，产生危险。

（3）将冰浴后的感受态细胞（含DNA）转移到电转化杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部（注意：其体积以填充电转化杯到电极之间空间即可，具体的用量可参见具体所使用的电转化杯的说明）。

（4）将电极杯推入电转化仪中，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入800μl的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml 的离心管中。

（5）37℃，220～250 rpm复苏40min。

（6）按照钙转步骤进行涂板培养。

【电击杯清洗流程】（1）用清水将电击杯稍冲一下。

（2）向电击杯中加入75%酒精浸泡2h。

（3）去酒精，再用蒸馏水冲洗2～3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。

（4）加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30min。

（5）去无水乙醇，于通风厨内挥发干乙醇。

（6）将清洗好的电击杯放入－20℃冰箱内待用。

【注意】不同样品使用的电转化杯应分开；若长期不用，应将清洗好的电转化杯浸泡在乙醇中。

高效感受态的制备----方法、技术要点总结转自螺旋讲堂标签: 讲堂螺旋感受态要点制备2010-11-24 16:10大肠杆菌感受态细胞的制备体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。

野生型E.coli并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。

为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出不同的方法处理细菌，经过多年的努力，科学家们发现了可以增加细胞吸收外源DNA效率的方法，那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。

这种经过理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态，该细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。

这种方法已经成为基因工程的常规技术，它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。

细菌的转化有两种类型：一种是自然转化（natural transformation），在自然转化中细菌可以自由地吸收DNA，通过它来进行遗传转化；另一种是工程转化（engineered transformation），在这种转化中，细菌发生改变使得它们能摄入并转化外源DNA。

枯草杆菌中的转化属于自然转化，E.coli转化就属于工程转化。

对于E.coli，目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。

其中，电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。

其转化效率为109～1010 转化子/μg DNA。

而对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。

转化效率为106 ～107转化子/μg DNA。

一、CaCl2感受态细胞的制备CaCl2感受态细胞的制备实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。