杧果Rab蛋白基因MiRab11的克隆及表达分析
- 格式：doc
- 大小：1.06 MB
- 文档页数：9
园 艺 学 报 2014，41（7）：1335–1343 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–03–28；修回日期：2014–06–05 基金项目：广西自然科学基金重点项目（2013GXNSFDA019011）；广西自然科学基金项目（2011GXNSFA018115） * 共同第一作者 ** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：honest66222@163.com）
杧果Rab蛋白基因 MiRab11 的克隆及表达分析 刘召亮1,*，罗 聪1,*，董 龙1，何新华1,2,**，艮文全1，李丽淑1，韦鹏霄1 （1广西大学农学院，南宁 530004；2广西农业科学院，广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，南宁 530007）
摘 要：根据前期对杧果（ Mangifera indica L.）胁迫差异分析中获得的 Rab11 片段，采用RT-PCR 结合RACE技术，从‘四季杧’混合组织材料（叶、茎、花和果实）中克隆了一个 Rab11 完整编码区序 列，命名为 MiRab11 。其cDNA全长902 bp，包含完整开放阅读框657 bp，编码218个氨基酸。同源性 分析表明 MiRab11 与葡萄和柑橘的同源性最高（相似度均为97%）。实时荧光定量检测结果表明： MiRab11 在杧果叶、茎、花和果实中均有表达，在嫩茎和花后70 d的成熟果实中的表达较高；在果实形成及发育 初期表达量略有下调，但在果实成熟过程中表达量明显上调；逆境胁迫（低温、盐、干旱）处理可引起 在叶或茎中上调表达；不同信号物质（脱落酸、水杨酸、双氧水）刺激均可引起叶中的表达上调。结果 表明， MiRab11 可能在杧果果实成熟和胁迫反应中发挥重要作用。 关键词：杧果； MiRab11 ；克隆；表达分析 中图分类号：S 667.7 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）07-1335-09
Cloning and Expression Analysis of a GTP-binding Protein MiRab11 Gene from Mangifera indica
LIU Zhao-liang1,*，LUO Cong1,*，DONG Long1，HE Xin-hua1,2,**，CAN Van Toan1，LI Li-shu1，and WEI Peng-xiao1
（1 College of Agriculture ， Guangxi University ， Nanning 530004， China ；2 Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Key Laboratory ， Nanning 530007， China ）
Abstract：A MiRab11 gene，which belonged to small GTP-binding proteins Rab gene family，was cloned by RT-PCR and RACE from Mangifera indica mixed tissues（leaves，stems，flowers，and fruits）.
The full-length cDNA sequence was 902 bp and contained an open reading frame of 654 bp，which encoded a 218 amino acid protein. The deduced amino acid sequence exhibited high homology with Vitis vinifera and Citrus sinensis （97% similarity）. Real-time quantitative PCR detection showed that the
ubiquitously expressed MiRab11 in young stems and fruit of 70 d after flowering was much higher than in other tissues；The expression level of the gene was down-regulated during early fruit development from 20 d to 50 d after flowering and up-regulated during fruit ripening from 50 d to 70 d after flowering；It could be up-regulated under different stress treatments（low temperature，salt，and drought）and stimulated by different signal molecules stimulation（abscisic acid，salicylic acid，and hydrogen peroxide）. In a word， a MiRab11 was identified from Mangifera indica ，which might be associated with mango fruit ripening and 1336 园 艺 学 报 41卷 play an important role in mango stress reaction. Key words： Mangifera indica ； MiRab11 ；cloning；expression analysis
Rab蛋白家族是Ras蛋白超家族中最大最复杂的小G蛋白，其编码蛋白质的分子量为22 ~ 25 kD，广泛存在于酵母、果蝇、小鼠、人类等真核细胞中，在膜泡运输过程中起作用。Rab蛋白作为 囊泡运输的分子开关，循环于GTP结合形式（活化状态）和GDP结合形式（无活性），通过不同结 合状态的转换，调节囊泡的出芽、转运、粘附和融合，参与细胞的分化，细胞的内吞和外排，胞内 蛋白的运输、交换和定位等（Noviek & Zerial，1997）。转水稻 rgp1 （Rab）基因的烟草在内源激素 含量、植株高度、花发育和对烟草花叶病毒的响应途径等方面都与野生型烟草有明显差异（Sano & Ohashi，1995）。紫御谷 PgRab7 受低温、干旱、盐及生长素诱导表达，过量表达可提高对盐和干旱 的抗性（Hutagalung & Novick，2011）。烟草 NtRab11 调控花粉管的极性生长（Agarwal et al.，2008）。 Rab11基因是Rab家族成员数量最多、定位与功能最复杂和多样的亚家族成员（Rutherford & Moore， 2002；Vernoud et al.，2003）。酵母基因组中有的两个Rab11蛋白（YPT31和YPT32），哺乳动物基 因组中有3个Rab11蛋白（Rab11a、Rab11b和Rab25），其功能已经有了比较深入的研究（Garcia-Ranea & Valencia，1998；Bhartur et al.，2000）。拟南芥基因组中有26个 Rab11 基因，但其功能尚未见报 道（Vernoud et al.，2003）。 近年来， Rab11 编码的蛋白也成为植物中的研究热点。过量表达烟草 Rab11b 的结构域突变体抑 制花粉管的极性生长（de Graaf et al.，2005）。bin Zainal等（1996）从成熟的杧果中分离了一个 MiRabX 基因，其仅在成熟果实中特异性表达。随后，Lu等（2001）以此序列为探针，从成熟前期的番茄果 实中分离到 SlRab11 基因，其反义基因转化的番茄植株的果实不能正常成熟软化。最近的研究表明， Rab11 可能与逆境胁迫反应有关。葡萄 VvRabA1c 、 VvRabA1e 和 VvRabA2a 基因受脱落酸诱导可上调
表达（Abbal et al.，2008）。转水稻 OsRab11 基因拟南芥及其突变体提高了对盐的耐受性（Son et al.， 2012）。从条斑紫菜中分离到的 PyRab11 基因，经原核蛋白诱导表达后可提高对盐的耐受性（王斌 等， 2012）。然而，在杧果中对Rab11功能的研究除 MiRabX 外未见其他报道。 作者在前期研究中克隆获得了多个与杧果逆境胁迫相关的功能基因，其中获得了 MiRab11 的部 分序列（Luo et al.，2012）。本试验中以 MiRab11 的部分序列为基础，用改良5′RACE（rapid- amplification of cDNA ends）技术克隆了 MiRab11 的全长序列，对序列进行了生物信息学分析，利用 实时荧光定量PCR对其在不同组织及其不同胁迫处理条件下的表达模式进行了分析和讨论。
1 材料与方法 1.1 植物材料与处理方法 所有样品于2012年3—6月采自广西大学农学院教学科研基地的果树标本园，试验在广西农业 科学院广西作物遗传改良与生物技术重点实验室完成，品种为‘四季杧’，砧木为土杧。不同组织及 各发育时期的果实均取自11年树龄的杧果树。逆境处理和信号物质刺激处理用穴盆栽培的1年树龄 ‘四季杧’嫁接苗，种植于无纺布种植带中。 组织样品包括老叶、嫩叶、老茎（已木质化）、嫩茎（未木质化）和花。从花后20 d果实开始， 每隔10 d取1次样，直到成熟，共7次。选择长势一致的1年龄‘四季杧’嫁接苗嫁接苗，在光照 培养箱中进行4 ℃低温处理；以清水为对照，设300 mmol · L-1 NaCl和30% PEG-6000处理，处理 后0、24、48、72 h采集叶片和茎。选择长势一致的1年龄‘四季杧’嫁接苗，分别喷0.1 mmol · L-1
