PCR产物的纯化

分子生物学实验报告实验内容：设计一个完整的实验，以水稻基因组为例，最终得到纯化的一个基因片段。

水稻基因组DNA提取以及基因片段的扩增、纯化和检测1.实验目的：1.1 熟练掌握实验室分子生物学相关的仪器的规范使用方法1.2 遵守实验室相关的实验规章制度，服从实验人员的管理1.3 熟练掌握实验室有关植物基因组DNA的简单提取方法以及检测方法1.4 了解琼脂糖凝胶电泳的原理，掌握胶体制备的方法以及电泳仪的操作方法1.5 掌握PCR技术的操作流程，熟练使用PCR仪并了解其工作原理及检测方法1.6 了解柱纯化的原理及使用方法2.实验原理1）水稻叶片基因组DNA提取水稻属于真核生物，其DNA以双链线性高分子形式存在于细胞核中，一般以染色质形式在。

由于植物组细胞破裂之后，DNA酶会水解DNA因此在提取过程总要加入EDTA螯合剂从而抑制DNA酶活性。

水稻叶片基因组DNA的提取主要是通过破碎组织和细胞从而通过对细胞内其他杂质的去处来达到基因组DNA的提纯。

提纯的产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检验。

本实验是通过CTAB法来进行提取的，它是一种阳离子表面活性剂，能溶解细胞膜和和核膜蛋白，使核蛋白解聚从而使DNA游离出来，已达到分离的目的。

2）特定基因片段的PCR扩增PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。

它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在95℃下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(55℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在TaqDNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的DNA 为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经30轮循环就可使DNA扩增上百倍。

产品介绍
本试剂盒适用于从 PCR 反应液或各种酶促反应液中纯化回收 DNA 片段。该试剂盒采用特殊的吸附膜，能够有选择性地 吸附核酸分子，去除反应液中的各种酶蛋白、引物、dNTP 等，得到高质量的 DNA 纯化产物，可直接用于酶切、测序等后续 的分子生物学试验。本试剂盒具有以下特点： 1. 适用范围广，回收效率高，对于100 bp 10~kb之间的DNA片段回收效率在90%以上。 2. . 洗脱效率高，洗脱体积最小可低至15 µl。
率。
3. 回收的片段为什么电泳上样会漂起来？ 主要原因是纯化过程中的乙醇没有去除干净。可将离心后的吸附柱开盖室温干燥 2~5 分钟，有助于残留的酒精挥发完全。
b. 盐份的残留。请确保使用 Wash Solution 冲洗两次，每次 500 µl 沿管壁加入，有助于彻底去除管壁上的盐份。 c. 回收后的 PCR 产物在反复冻溶的情况下，会加速末端 A 和整个 PCR 产物的断裂，从而造成与 T 载体连接或直接酶切
效率的下降。建议回收后立即进行酶切或连接实验。 d. 选择合适的 PCR 产物和 T 载体的分子数比例，有助于提高连接效率. e. 请确保 PCR 最后 72°C 5~10 分钟的延伸时间，这样才有足够的 PCR 产物在末段带有 A 附加碱基，保证较高的连接效
标准纯化步骤
1. 将PCR反应液或酶促反应液移至一干净的1.5 ml离心管中，加入3倍体积的Buffer B3，充分混匀。 首次使用前请先检查是否已加入适量的异丙醇。 若反应液体积过小，可用 TE 或水补足至 100 µl，然后再加入 300 µl Buffer B3。 2. 将混合液全部移入吸附柱，8,000 × g离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 如果体系总体积大于 750 µl，则每次使用 750 µl，多次上柱。 将滤出液再次加入吸附柱中再次过柱，可以进一步提高 DNA 回收率。 3. 向吸附柱中加入500 μl Wash Solution，9,000 × g离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 Wash Solution 首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。 4. 重复步骤3一次。 5. 将空吸附柱和收集管放入离心机，9,000 × g离心1 min。 此步绝不可省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。 6. 在吸附膜中央加入15~40 μl Elution Buffer，室温静置1~2 min，9,000 × g离心1 min。将所得到的DNA溶液置于-20°C

pcr考试题及答案PCR考试题及答案1. PCR反应中，变性步骤的温度通常设置为多少？A. 94℃B. 55℃C. 72℃D. 37℃答案：A2. 以下哪种酶是PCR反应中常用的热稳定DNA聚合酶？A. 限制性内切酶B. 逆转录酶C. Taq聚合酶D. 连接酶答案：C3. PCR产物的纯化方法不包括以下哪种？A. 乙醇沉淀B. 凝胶电泳纯化C. 离心分离D. 柱层析纯化答案：C4. PCR反应体系中，引物的作用是什么？A. 提供DNA聚合酶的结合位点B. 提供DNA模板C. 提供dNTPsD. 提供镁离子答案：A5. 在PCR反应中，哪种dNTPs的缺失会导致反应停止？A. dATPB. dCTPC. dGTPD. dTTP答案：以上任何一种缺失都会导致反应停止6. PCR产物的检测方法有哪些？A. 琼脂糖凝胶电泳B. 聚丙烯酰胺凝胶电泳C. 实时定量PCRD. 所有以上方法答案：D7. PCR反应中，Mg2+的浓度对反应有何影响？A. 增加Mg2+浓度可以提高反应效率B. Mg2+浓度过高会抑制DNA聚合酶活性C. Mg2+浓度过低会导致非特异性扩增D. 所有以上情况都可能发生答案：D8. 以下哪种PCR技术用于检测基因突变？A. 常规PCRB. 定量PCRC. 突变PCRD. 逆转录PCR答案：C9. PCR产物的克隆方法包括哪些？A. TA克隆B. 限制性酶切克隆C. 同源臂克隆D. 所有以上方法答案：D10. PCR反应中，变性、退火和延伸三个步骤的循环次数一般是多少？A. 20-30次B. 30-35次C. 35-40次D. 以上都有可能，取决于实验设计答案：D。

PCR产物回收、酶切鉴定1.1实验目的1.掌握PCR产物回收和酶切鉴定的基本原理2.熟悉PCR产物回收和酶切鉴定的具体操作过程3.鉴定β-珠蛋白基因（β-Gbobin gene）多态性1.2实验原理1.2.1 PCR产物回收实验原理PCR产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。

目前核酸纯化的方法有很多，回收试剂盒的出现使DNA的纯化过程变得更加简便、快捷。

试剂盒PCR回收原理：试剂盒中回收管内所带的硅基质膜，具有在高盐、低pH值情况下吸附DNA，低盐、高pH值情况下释放DNA 的性质。

1.2.2 酶切实验原理限制性内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。

β-珠蛋白基因PCR产物中含有AvaⅡ酶切位点，会被AvaⅡ酶切割。

1.3方法步骤1.3.1 PCR产物纯化操作步驟1. 将PCR 反应产物移至干净的1.5ml离心管。

2. 加入3 倍体积的Binding Solution 至反应产物溶液( 50 μl 的PCR 溶液，加入150 μl 的Binding Solution并振荡混合均匀）3. 将Spin column 放入Collection tube 中，将反应溶液放入spin column 中，以12,000 ×g离心1 分钟，丢弃collection tube 中的液体。

4. 加入700 μl 的Wash Solution，于12,000×g离心1 分钟。

丢弃废液, 重复此步驟一次。

5. 丢弃废液，12,000 ×g离心去除残余的酒精。

6. 将spin column 转移至新的1.5ml离心管(microcentrifuge tube) 并加入30μl 的Elution Solution 或H2O (pH7.0~8.5) 至column，静置2分钟。