Western Blot protocol
1，制样：将获得的细胞用PBS洗涤，300gx4℃x5min,弃去上清。加SDS loading buffer 搅拌转移到1.5ml离心管。放到干浴锅100℃煮10min，放入冰上5min，最后存入-20℃冰箱待用。
2，将样品取出待用，可100℃煮2min，待上样。
3，配胶：浓缩胶5%，分离胶8%，10%或12%（分子大用低浓度，分子小用高浓度Caspase3 35kD，12%浓度(活性形式17kD)；DAPK1/p-DAPK1 160KD 18%浓度）：ddH2O，30%Acrylamide, 1.0M/1.5MTris-HCL, 10%SDS, 10% AP, TEMED按比例加。
1）夹好板子，用ddH2O捡漏，5min。
2)按照顺序加入试剂配胶配分离胶（50ml管子），混匀。
3）加胶7ml，大致与夹子的门平齐。随后轻轻加3ml乙醇液封页面。静置
30min。
4）将乙醇倒掉，用ddH2O清洗3遍。
5）制备浓缩胶，加入3ml左右只玻璃板界面，插入梳子。
6）静置30min后拔掉梳子。取下玻璃板用ddH2O 冲洗边缘。
7）若不立即使用可用保鲜膜将其包好放在4℃冰箱。（TEMED在灌胶前加入）4，上样：
1）固定好玻片，加入running buffer 没过底板，盖上盖子。
2）浓缩胶75-80V 30min左右，分离胶100V-120V 1h左右。
5，转膜：
1）取出玻璃板，用切胶器轻轻撬动取掉小玻片，切去浓缩胶（将分离胶放入放
入ddH2O水中浸泡5min，重复三次）再放入trans buffer中放置10min。2）剪一块与胶一样大的PVDF膜放在甲醇中浸泡，使其带正电。
3）将PVDF，海绵垫，滤纸放入trans buffer浸泡几分钟。
4）在黑色面板依次放入海绵垫，至少3层滤纸，胶，转移膜，注意不能有气泡，再放滤纸，海绵垫形成夹心结构。(大分子用0.4 um PVDF 膜，小分子用0.25um PVDF膜)。
5）关上夹子将其转入放在冰上的电泳槽，黑对黑，白对红，加trans buffer关上盖子。200mA 1-2h或恒压100V 1-2h（大分子250mA 3小时左右）。
6，免疫反应：
1）取出膜，与胶接触的为正面，正面朝上，放入牛奶或5%TBST牛血清中摇床2h封闭，或放入4℃冰箱过夜。
2)倒掉封闭液，分别剪下有内参蛋白和待测蛋白的膜，分别加内参抗体TBST：抗体=10000:1 5ml左右，待测抗体TBST：抗体=1000:1 5ml左右（最好分开孵育当A蛋白和B蛋白分子量差别5KDa以上（10KDa左右更保险），可将膜分割开（分别标记不同的抗体），这样就不需要stripping膜重新标记，且一次就能得到想要的结果。有人会将两种抗体混在一起标记整张膜，这样操作的前提是非常熟悉这两种抗体的杂带位置，且各自的杂带都不会干扰目的蛋白才可以如此操作；并且这样的抗体下次使用有了局限性，因此不太推荐) 在摇床上孵育1-2h，较难杂的4℃孵育过夜或者更久。
3）回收一抗。用TBST在摇床洗膜4次，每次10-15min左右。(再用TBS洗一次10min)。
4)孵二抗浓度1:1000，1h。
5）用TBST在摇床洗膜4次，每次10-15min左右。(再用TBS洗一次10min)。
7，显影：显影液A和显影液B 1:1 配制，避光现用现配。
(TBST要测PH值7-7.4之间)
