*基金项目：浦东新区中医中青年骨干培养项目（PWZ2008－20－q02）；上海市科学技术委员会科研计划项目（11ZR1437700）；上海市教育委员会科研创新项目（09JW32）；上海市卫生局中医药科研基金（2008L046A ）；上海市教育委员会E －研究院建设计划资助项目（E03008）；上海高校创新团队建设项目。
△通讯作者：陈刚，副主任医师，硕士生导师，E-mail ：chengang6@
糖肾宁对早期糖尿病肾病大鼠肾组织非酶糖
基化终产物的影响*
王东1，吴同茹1，谢婷婷1，黄迪1，2，3，陈刚1，2，3，△
，曹和欣1，2，3，何立群1，2，3（1．上海中医药大学附属曙光医院，上海200021；2．上海市中医临床重点实验室，上海200021；
3．上海市高校中医内科E －研究院，上海200021）
摘要：目的:探讨糖肾宁对早期糖尿病肾病(DN )大鼠肾组织非酶糖基化终产物(AGEs )的影响。
方法:雄性
SD 大鼠32只，随机取8只为正常对照组(A 组)，给予普通饲料喂养，4周后，腹腔注射枸橼酸－枸橼酸钠缓冲液(30mg /Kg );其余24只为糖尿病(DM )造模组，采用高脂饲料喂养，4周后，按30mg /Kg 腹腔注射链脲佐菌素(STZ )建立DM 大鼠模型，2周后，测定24h 尿微量白蛋白排泄量(24hU －A1b )，按24hU －A1b 排泄量随机分为模型组(B 组)、糖肾宁组(C 组)、氨基胍组(D 组)。
8周后，检测各组大鼠血糖、24hU －Alb 以及肾组织AGEs 的水平。
结果:B 组大鼠血糖、24hU －Alb 、AGEs 水平明显高于A 组(均P ＜0.01)。
经糖肾宁、氨基胍治疗后，24hU －Alb 、AGEs 水平均有所下降，与B 组大鼠差别有统计学意义(均P ＜0.01)，但仍高于A 组(均P ＜0.05);同时，经糖肾宁治疗后大鼠血糖明显下降，而D 组大鼠血糖无明显变化。
结论:糖肾宁具有氨基胍类似作用，可抑制蛋白质非酶糖基化反应，并具有降低血糖、24hU －Alb 的作用。
关键词：糖肾宁;氨基胍;糖尿病肾病;糖基化终产物中图分类号：R285.5
文献标识码：A
文章编号：1000－3649（2013）01－0053－03
Effect of Tangshenning on Nonenzymatic Advanced Glycation End Products of Nephridial Tissue in Early Diabetic
Nephropathy Rats /WANG Dong 1，WU Tongru 1，CHEN Gang 1，2，3，△
，et al．//1．Affiliated Shuguang Hospital ，Shanghai U-
niversity of Traditional Chinese Medicine （Shanghai 200021，China ）；2．Clinical Key Laboratory of Traditional Chinese Medi-cine （Shanghai 200021，China ）；3．Traditional Chinese Medicine Internal Medicine E －institute of Shanghai University （Shanghai 200021，China ）
Abstract ：To study the effect of Tangshenning on nonenzymatic advanced glycation end products （AGEs ）of nephridial tis-sue in early diabetic nephropathy rats．Methods ：32male SD rats were randomly divided into normal control group （group A ，n =8）and diabetic group （n =24）．Group A with conventional diet for 4weeks ，was injected intraperitoneally with 30mg /kg of citrate buffer．Diabetic group with high fat diet for 4weeks ，was injected intraperitoneally with 30mg /kg of STZ．After 2weeks ，24hU －Alb was measured．According to 24hU －Alb ，the 24SD rats were randomly divided into model group （group B ，n =8），Tangshenning group （group C ，n =8）and aminoguanidine group （group D ，n =8）．After 8weeks ，the level of blood glucose ，24hU －Alb and tissue AGEs were measured．Results ：The levels of blood glucose ，24hU －Alb and AGEs in rats of group B were obviously higher than those of group A （all P ＜0．01）．The levels of 24hU －Alb and AGEs of group C and D were obviously low-er than those of group B （all P ＜0．01），but higher than those of group A （all P ＜0．05）．The levels of blood glucose of group C was obviously lower than those of group B ，but group D was not obviously change．Conclusion ：Similar to aminoguanidine ，Tangshenning has effect on inhibiting the action of proteinum non －enzymatic glycosylation reaction and decreasing blood glucose and 24hU －Alb．
Keywords ：Tangshenning ；Aminoguanidine ；Diabetic nephropathy ；Advanced glycation end products 糖尿病肾病（Diabetic nephropathy ，DN ）是糖尿病（Diabetes mellitus ，DM ）
严重的微血管并发症，
其发生率在DM 病程的20 25年后高达50%以上，是导致终末期肾功能衰竭的最主要原因，显著增加
患者死亡率［1，2］。
DM 慢性高血糖引起体内蛋白糖化，
使得大量蛋白非酶糖化产物转化为不可逆的糖基化终产物（Advanced glycation end products ，AGEs ）
在
组织内沉积，并引起广泛的蛋白质交联，是血管病变的主要特征。
AGEs 在DN 介导发生发展中的作用
已被越来越多的研究所证实［3 6］。
本实验通过喂养高脂饲料加小剂量腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin ，STZ ）的方法诱导大鼠糖尿病模型，并以AGEs 生成抑制剂氨基胍为对照，观察了中药糖肾宁对早期DN 大鼠肾皮质蛋白质非酶糖化的影响。
现将结果报告如下。
1材料和方法1.1
实验动物
清洁级雄性SD 大鼠32只，6周龄，
体重180 200g ，由上海西普尔－必凯实验动物有限
·
35·2013年第31卷第01期Vol．31，No．01，2013
四川中医
Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine
公司提供，许可证号：SCXK （沪）2008 0016，动物的合格证编号：2008001605608。
实验期间自由饮水，摄食饲料由上海中医药大学动物实验中心提供，适应性喂养1周后进行实验。
室温20 24ħ，相对湿度45ħ。
1.2
试剂和仪器
链脲佐菌素（streptozotocin ，
STZ ）、氨基胍、胶原酶Ⅳ、HEPES 缓冲液均购自美国Sigma 公司。
糖肾宁由太子参30g 、生黄芪30g 、生地15g 、泽兰12g 、鹿角片12g 、黄连6g 等组成，药物饮片由曙光医院门诊药局提供，水煎浓缩，每
ml 含生药3.5g 。
24h 尿微量白蛋白（24hU －A1b ）试剂盒购自南京建成生物有限公司。
高速冷冻离心机、721分光光度计均购自上海安亭科学仪器厂。
血糖仪、血糖试纸均由天津九安医疗电子股份有限公司提供。
1.3方法
1.3.1
糖尿病大鼠模型的建立及分组
32只大鼠进
入实验室适应性饲养1周后，随机取8只为正常对照组（A 组），其余为糖尿病造模组。
参考文献
［7，8］
的
方法诱导DM 模型：将造模大鼠给予高脂饲料（普通饲料加10%猪油，10%豆油，10%蔗糖），连续饲养4周后，禁食12h ，按30mg /Kg 的剂量一次性腹腔注射STZ （溶于0.1mol /L 枸橼酸－枸橼酸钠缓冲液，pH 4.2）。
注射1周后，尾静脉采血，测定血糖，以血糖＞16.7mmo1/L 作为糖尿病造模成功，未成功者剔除。
2周后，将造模成功的大鼠分别置于代谢笼内留取24h 尿液，测定24h 尿微量白蛋白排泄量（24hU －A1b ），然后按24hU －A1b 排泄量随机分为模型组（B 组）、糖肾宁组（C 组）、氨基胍组（D 组）。
A 组大鼠给予普通饲料喂养，仅注射等量的枸橼酸－枸橼酸钠缓冲液，72h 后尾静脉取血，测定血糖。
1.3.2
给药方法
糖肾宁组（C 组）、氨基胍组（D
组）大鼠分别予相应药物灌胃，用药量按临床成人每日每千克体重用量的20倍折算（糖肾宁按生药35g ·kg －1·d －1，氨基胍灌胃100mg ·kg －1·d －1）。
正常对照组（A 组）、模型组（B 组）均给予等量蒸馏水灌胃。
观察8周后，代谢笼内留取24h 尿液，2%戊巴比妥钠麻醉下腹主动脉采血检测相关指标。
1.3.3检测指标血糖采用血糖仪检测，24hU －Alb 采用放射免疫法检测。
肾皮质AGEs 参照Nakayama
等［9］和Brownless 等［10］方法测定，具体步骤：将冷冻保存的肾皮质精密称量200mg ，加5ml pH7.4冷磷酸盐缓冲液（PBS ）组织匀浆60s ，于4ħ6500r /min
离心30min ，去上清液，沉淀中加氯仿－甲醇（2ʒ1）5ml ，轻摇，4ħ过夜，以去脂。
加入甲醇2ml 、蒸馏水0.5ml ，水化，自然沉淀，于4ħ6500r /min 离心30min ，去上清液，将沉淀用甲醇2.5ml 洗2次，蒸馏水2ml 洗3次，再用pH7.5HEPES 缓冲液洗2次，沉淀物于5ml HEPES 缓冲液中4ħ过夜。
3000r /min 离心10min ，去除缓冲液，将沉淀物悬浮于1ml 含0.1g /L Ⅳ型胶原酶的HEPES 缓冲液中，37ħ轻摇震荡消化24h ，于4ħ8000r /min 离心5min ，留取上清消化液，于波长370/440nm 测定相对荧光强度，以含Ⅳ型胶原酶的HEPES 缓冲液荧光值为1个任意荧光单位（AUF ），样品荧光强度依此折算。
进行羟脯氨酸含量测定，将测得的羟脯氨酸值乘以因子7.14，即为胶原含量。
最后肾皮质中糖化终产物含量以每毫克胶原中相对荧光强度（AUF /mg ）表示。
1.3.4
统计方法
采用SPSS13.0软件包进行统计，
计量资料数据用均数ʃ标准差（x －
ʃs ）表示，组间比
较采用单因素方差分析，取P ＜0.05为有统计学意
义。
2结
果
2.1
造模过程大鼠一般情况观察
正常对照组（A
组）：大鼠精神状况良好，毛色光泽，动作自如，反应灵敏，体重增加明显。
DM 模型组（B 组）：大鼠精神逐渐萎靡，出现DM 典型的“三多一少”症状，早期多动，后期反应迟钝，毛色灰暗无光泽，小便量多，每天需换垫料1 2次，有1只因血糖过高在实验结束时死亡。
糖肾宁组（C 组）：与B 组比较，大鼠“三多一少”症状明显改善，体重有所增加。
氨基胍组（D 组）：与B 组比较，大鼠精神状况良好，体重增加。
2.2
各组大鼠血糖和24hU －Alb 的水平模型组大鼠的血糖、24hU －Alb 水平均高于正常对照组（P ＜0.01）；经糖肾宁、氨基胍治疗后，24hU －Alb 水平均有所下降，与模型组比较有显著性差异（均P ＜0.01），但仍高于正常对照组（均P ＜0.05）；同时，经糖肾宁治疗后大鼠血糖明显下降，而氨基胍组大鼠血糖无明显变化。
见表1。
表1
各组大鼠血糖和24hU －Alb 的水平比较（x －
ʃs ）
组别n 血糖（mmol /L ）
实验前实验后24hU －Alb （μg /ml ）
实验前实验后正常对照组8 6.18ʃ1.15 6.21ʃ1.04 6.41ʃ0.73 6.39ʃ0.76模型组721.34ʃ9.41▲23.45ʃ9.56▲19.65ʃ8.43▲21.53ʃ10.65▲糖肾宁组821.42ʃ9.35▲18.23ʃ8.97▲＊＊19.57ʃ8.52▲10.72ʃ7.53▲＊＊氨基胍组
8
21.29ʃ9.57▲
22.89ʃ9.71▲＊＊
19.61ʃ8.49▲
18.97ʃ8.48▲＊＊
注：与正常对照组比较，▲P ＜0.01，＊＊P ＜0.05；与模型组比较，*P ＜0.01
2.3各组大鼠肾组织AGEs 水平模型组大鼠的AGEs 水平高于正常对照组（P ＜0.01）；经糖肾宁、
·
45·四
川中医
Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine
2013年第31卷第01期Vol．31，No．01，2013
氨基胍治疗后，AGEs水平均有所下降，与模型组比较有显著性差异（均P＜0.01），治疗组间无统计学意义（P＞0.05），但仍高于正常对照组（均P＜0.05）。
见表2。
表2各组大鼠肾组织AGEs水平比较（x－ʃs）组别n x－ʃs（AUF/mg）正常对照组8161.71ʃ31.53
模型组7544.47ʃ50.43▲
糖肾宁组8333.21ʃ69.44▲●
氨基胍组8205.27ʃ14.63＊●
注：与正常对照组比较，▲P＜0.01，*P＜0.05；与模型组比较，●P＜0.01
3讨论
DM是一种常见病、多发病，其各种慢性并发症是DM患者致残、致死的主要原因。
目前对DM慢性并发症的发病机制尚未完全阐明，主要有4种学说，即蛋白激酶C系统学说、氧化应激学说、多元醇通路学说和蛋白非酶糖基化学说。
其中，蛋白非酶糖基化学说是目前研究的热点之一。
持续高血糖引起的蛋白质非酶糖基化及其由此形成的AGEs增多，在DM慢性并发症的发病机制中起重要作用。
AGEs可以通过与其受体和结合蛋白共同作用来影响生长因子和细胞因子在肾脏的表达，促进DN的发展。
在DM中，AGEs的效应亦可与通过其他致病途径发挥协同作用，包括肾素－血管紧张素系统的激活、氧化应激等。
AGEs既可激活多种致病途径，同时多种致病途径又可促进AGEs的生成，从而形成恶性循环，加速肾脏的损害。
因此，抑制AGEs的生成或消除已经生成的AGEs，很可能是将来治疗DN的重要措施之一［11］。
氨基胍是一类具有亲核作用的肼类化合物，比蛋白质中赖氨酸ε－氨基更活跃，通过与早期非酶糖化过程中的中间产物（Amadori产物）或其衍生物如3－脱氧－D－葡萄糖酮醛作用，使Amadori产物转化为替代性Amadori产物，阻止它进一步转变为AGEs，改善高血糖状态下AGEs在血管壁上的积聚和AGEs 对组织细胞的毒性作用，发挥其对DN的防治作用［12］。
但其毒副反应较大，限制了临床应用。
因此，研制和开发新的AGEs抑制剂具有更深远的意义。
糖肾宁是上海中医药大学附属曙光医院依据多年临床实践经验总结出的中药复方制剂，该方由太子参、生黄芪、生地、泽兰、鹿角片、黄连等组成，方中生黄芪味甘，性温，益气补虚，生地甘寒质润，气味俱厚，性沉而降，滋补肾中真阴，两药相配，升降相合，阴阳同用；太子参味甘，性微温，健脾补肺、大补元气，在方中以助黄芪补中益气之力；黄连用量少，能清热泻火，与生地相合，降心火滋肾水，水火相济，津液自生，气血得养；泽兰活血利水；鹿角片温阳，助阳则阳生阴长，既有阳中求阴，又有防止疾病传变至阴阳两虚之意。
研究结果显示：糖肾宁和氨基胍均能不同程度地降低DM大鼠24hU－Alb、AGEs水平，发挥对肾脏的保护作用。
糖肾宁治疗后DM大鼠血糖明显下降，而氨基胍组大鼠血糖无明显变化。
提示氨基胍无降糖作用，但可通过抑制氧化糖基化对肾脏具有确切的保护作用。
本实验显示，糖肾宁具有类似氨基胍的某些药理作用，具有抑制蛋白非酶糖基化的作用，而且中药毒副反应低，价格低廉，加上DN病程迁延，这就决定其用药治疗的过程将是长期的甚至是终生的，药物的不良反应及费用均应考虑，因此我们认为，糖肾宁在防治DN中有较好的临床应用前景。
参考文献
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(收稿日期2012－09－11)
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四川中医
Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine。
