伊文思蓝(EB)检测血脑屏障(BBB)通透性

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1、测定血脑屏障完整性原理
伊文思蓝属于一种常用的偶氮染料制剂,因其分子量大小与血浆白蛋白相近，而且在血
液中与血浆白蛋白有很高的亲和力，由于正常状态下血浆白蛋白无法透过血脑屏障，所以染
色时，如神经系统是完整的，与血浆白蛋白结合的依文思蓝无法使其着色。相反如果神经系
统血脑屏障被破坏，依文思蓝就可以进入神经系统并使其着色。在荧光波长470与540 nm
各有一强峰，680 nm处有一弱峰。其在组织中的含量常使用化学透析法和比色法进行检测。

脑组织中血脑屏障的破坏，可以引起毛细血管的通透性增加，结合EB的白蛋白可通过
BBB进入脑组织，应用化学比色法甲酰胺测定脑组织EB渗出量，可以反映血脑屏障的开放
程度，并在此基础上进一步探讨不同细胞移植干预与BBB通透性的效应关系。
伊文思蓝灌注染色法结合共聚焦激光扫描显微镜观察脑切片中EB荧光强度，可以检测
血脑屏障中血管形态的改变，同时对脑组织中渗入的EB含量进行定量分析。
两者结合可以从形态学、组织定量上相互补充完善。

2、实验准备

试剂：
2%EB、1%戊巴比妥钠、0.9%氯化钠、20U/ml肝素钠、二甲基甲酰胺

器材：冰冻切片机、共聚焦激光扫描显微镜、分光光度计、恒温箱、离心机、注射器、输液
器、解剖器械等

3、测定方法

1、各组动物处死前0.5h（也有的为1h、2h）尾静脉（或股静脉）注入2%EB（2ml/kg，也
有的用3、4ml/kg）（剂量与提前时间成反比？）
2、1%戊巴比妥钠30-40 mg/kg麻醉后打开胸腔，心内灌注肝素生理盐水（0.9%氯化钠
+20U/ml肝素钠）200-300ml（有文献提出当右心房流出液体变清澈时即可停止灌注），断
头取脑作矢状切取半脑分离海马，一半脑组织进行冰冻切片，应用冰冻切片机行10-20μm
切片，于共聚焦激光扫描显微镜下观察 EB通透情况。
3、另一半脑组织称重，剪碎置于二甲基甲酰胺（1ml/100mg脑组织，也可用三氯乙酸、甲
酰胺）60℃孵育24h，1000r/min离心5min（有的作者认为脑组织在甲酰胺中匀浆呈胶状，
上清液不能通过离心取得，水浴后直接取上清液比色），用分光光度计检测波长为620 nm
的吸光度。
4、采用软件（Oringen7.0）进行数据分析，根据绘制的EB标准曲线计算EB含量。

4、试剂购买
EB
二甲基甲酰胺
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