蛋白质间相互作用检测方法的研究进展

・综述・蛋白质间相互作用检测方法的研究进展黄显金１刘（１．解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所，北京蛋白质是生命活动的基本功能单元，一切生理反应变化都离不开蛋白质以及蛋白质问的相互作用，人们不仅需要了解单个蛋白的结构及功能，更需要了解蛋白质组内部作用的功能过程，因此，了解蛋白一蛋白甚至蛋白一核酸相互作用的检测方法对于我们开展相关研究甚为重要。蛋白质相互作用分为３个方面：一是多亚基蛋白质的形成；二是多成分的蛋白复合体，如核孔复合体等；三是瞬时蛋白质相互作用。本文拟就蛋白质问相互作用检测方法的研究进展作一综述。１蛋白质亲和层析将所研究蛋白的配体蛋白预先连接在基质如琼脂糖珠上，连有配体蛋白的琼脂糖置于过滤柱上，当含有所研究蛋白的混合悬液经过过滤柱时，目标蛋白就会粘在柱子上。然后用低盐缓冲液冲去杂质，再用高盐缓冲液或者十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）将粘在柱子上的目标蛋白洗脱下来进行检测。在亲和柱上，可利用纯化的融合蛋白以两种方式检测相互作用［１’２］：一种是将融合蛋白共价连接在树脂上，让抽提物过柱；二是把融合蛋白非共价结合于琼脂糖珠上，使抽提物和珠子混在一起。该方法具有较高的灵敏性Ｅ３１，但可能存在假阳性，如２个蛋白通过中间蛋白相互连接也会被抽提出来。２亲和印迹蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）胶分离后，转移至硝酸纤维素膜上，然后利用特异性蛋白质、肽段或配体作为探针检测膜上的蛋白质。该技术与免疫印迹方法不同的是，免疫印迹使用抗体作为检测的探针。该方法可以直接分析全细胞裂解液等蛋白质复合物，而不需要纯化蛋白。所以，它特别适合于分析膜蛋白［”，如细胞受体等。但是，需要特别注意的是，通常混合物在有ＳＤＳ存在的情况下分离，而在印迹时需要去除变形剂，使变性的蛋白质全部或部分复性。如果蛋白质在变性后无法复性，则需要一个非变性的胶分离系统。３免疫共沉淀免疫共沉淀是一种非常经典的蛋白质一蛋白质作用分析方法。用带基质（如琼脂糖珠）的抗体将细胞裂解混合物中的蛋白复合物沉淀下来，再用另一种抗体检测是否蛋白复合物中有所需要的目标蛋白。用此方法可检测到自然生理条件下的蛋白一蛋白作用，可信度高，但是最好使用单克隆抗・１８３・辉２姚咏明１１０００４８；２．解放军总医院重症监护科，北京１００８５３）

体，以防制备多克隆抗体时污染的其他抗体存在或者多克隆抗体自身的干扰。检测到的阳性结果可能是间接通过第三方蛋白结合。而且检测灵敏度比亲和层析的方法低。

４谷胱甘肽转移酶沉淀实验（ＧＳＴ－ｐｕｌｌｄｏｗｎ）

该方法的原理为，将研究的目的蛋白Ｘ与谷胱甘肽转移酶（ＧｓＴ）融合，在原核或真核细胞中表达［５］，将ＧＳＴ－Ｘ应用蛋白纯化技术分离出来，结合到ＧＳＨ琼脂糖珠上。然后将另一种蛋白质Ｙ（可通过体外翻译的方法得到，纯度较高，标记有放射性同位素）加入其中，如果两种蛋白质存在相互作用，则形成ＧＳＴ－ｘ＿Ｙ复合物琼脂糖珠，被沉淀下来。如果内源性蛋白含量低或者结合力弱，ＧＳＴ沉淀实验往往难以成功，可采取放射性标记法标记细胞蛋白，通过放射自显影检测相互作用蛋白。该实验须选择合适的细胞及细胞状态。有些蛋白质的相互作用会受到细胞类型、细胞状态、外界刺激因素等条件的影响。

ｓ化学交联法

使用一种交联试剂，并且在交联试剂的光激活部分带有标记，将该试剂耦联到一蛋白质上，耦联体与蛋白质混合物反应，如果目标蛋白可与带有交联试剂的耦联蛋白质相互结合，则结合后用光激活交联试剂，使交联试剂一部分结合至目标蛋白上。再加入还原剂，切割交联试剂，使目标蛋白携带交联试剂上有标记的部分，然后跑胶，分析该蛋白质。交联剂是一类小分子化合物，相对分子质量～般在２００～６００之间，具有２个或者更多的针对特殊基团（氨基、巯基等）的反应性末端，可以同２个或者更多的分子分别耦联从而使这些分子结合在一起。ＩＡＣ、Ｄｅｎｎｙ－Ｊａｆｆｅｅ试剂等为较常用的交联剂ｍ，Ｊ。这种方法灵敏度较高，而且能通过可穿膜的交联剂，检测体内的蛋白质相互作用［８］，可发现瞬时蛋白质相互作用，但该方法有一定的假阳性率。

６荧光共振能量转移法（ｆｌｕｍ－ｅｓｏｅｍ鼍豫啪蝴ｅｎｅｒｇｙｔ１．１ｕ碰ｅｒ。

ＦＲＥＴ）

ＦＲＥＴ是一种无辐射、量子级能量转移现象，即指当一个荧光分子（供体）受到激发时，能量向邻近的另一荧光基团

基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０８０１１８７。３０６７２１７８），国家重点基础研究发展规划项目（２００５ＣＢ５２２６０２）通讯作者：姚咏明（Ｅｍａｉｌｌｃ＿ｆｆ＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ）

万方数据・１８４・（受体）转移的过程。但仅当受体与供体的距离小于１０ｎｍ且受体的吸收光谱和激发光谱有重叠时，ＦＲＥＴ才能发生。并且随着光谱重叠的增加，ＦＲＥＴ的效率将增高，同时ＦＲＥＴ发生的距离也可能相应增大。该方法可用于研究活细胞内蛋白质一蛋白质之间的相互作用以及蛋白质分子内的构象变化。将两个蛋白质分别使用ＣＦＰ／ＹＦＰ（或ＢＦＰ／ＧＦＰ）标记，当二者在同一细胞中表达时，只要检测到ＦＲＥＴ发生，则证明两个蛋白间距小于１０ａｍ，存在相互作用。该方法可观察。活体内生物大分子的相互作用，已成功观察到ＦＨＩ．３与ＦＨＬ２之间的相互作用曲３。但此方法也同时受到活体内信号弱、细胞自发荧光等不利因素的影响。

７表面等离子共振技术（ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍａｒｅｓｏｎａｎｅ．Ｊｅ．ＳＰＲ）

表面等离子共振是一种物理光学现象。当入射光以临界角入射到两种不同透明介质界面（如镀在玻璃表面的金属金或银的薄膜）时，可引起金属自由电子的共振，电子吸收光能量从而使反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的入射光角度称为共振角（ＳＰＲ角）。ＳＰＲ角随金属表面的折射率变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比，因而可通过对生物反应过程中ＳＰＲ角的动态变化获取生物分子相互作用的特异信号。当应用计算机附带软件分析芯片上配体与待检分子的结合时，须考虑待检蛋自流速及浓度、配体种植密度、二者亲和力大小等因素，软件能按照操作者的意图计算出初始结合速率。目前此技术已广泛应用于检测抗原一抗体、受体一配体、蛋白质一核酸、蛋白质一小分子等之间的相互作用［１“。

８噬菌体展示技术将外源蛋白或小肽展示在噬菌体的表面，通过筛选可以找到与目标蛋白相互作用的蛋白质。噬菌体能在其表面表达一种融合蛋白，该融合蛋白包含外源肽段，能与抗体结合［１“。通过免疫亲和纯化，富集到表达所需蛋白的噬菌体。结合的噬菌体被保留下来，感染大肠杆菌，经过几个周期后，可以富集结合紧密的肽段的ＤＮＡ序列。该技术具有高度选择性，还可以构建大规模的噬菌体文库（１０９～１０”），而且可通过改变洗脱步骤的严格性，来评价融合蛋白结合的特异性。可用于筛选抗原表位、蛋白质酶抑制剂、蛋白质功能位点分析、大分子蛋白（糖蛋白）的小分子模拟物、疫苗研究、糖类表位的模拟表位等，还应用于疫苗、构建抗体库，筛选不同动物源性的抗体、构建ｃＤＮＡ文库，进行免疫筛选，寻找新蛋白或相互作用蛋白。但是该技术尚存在一些不足：①所研究蛋白必须可被大肠杆菌分泌；②多价展示通常只限于小肽段，因为大肽段会影响噬菌体被膜蛋白的功能和噬菌体的感染力；③由于是体外实验，蛋白质在宿主细菌中有时无法正确折叠或修饰；④构建的融合蛋白会影响蛋白本身的活性。９酵母双杂交或多杂交酵母细胞便于转化，易于筛选。而且内源性酵母蛋白质极少与哺乳动物细胞靶蛋白质结合，避免了对文库编码蛋白质的干扰。其具体方法是，把报告基因ＨＩＳ３或ｌａｃｚ整合到酵母基因组中，并受转录因子ＧＡＬ４的调控。只要ＧＡＬ４结合到报告基因ＨＩＳ３或ｌａｃＺ的调控序列上，就启动报告基因的表达。ＧＡＬ４转录因子由两部分构成，ＤＮＡ结合区（Ｇａｌ４ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，ＧＢＤ）和转录激活区（Ｇａｌ４ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｄｏｍａｉｎ，ＧＡＤ）。分别将ＧＢＤ和ＧＡＤ构建到两个不同的载体上，并表达融合蛋白ＧＢＤ－Ｘ和ＧＡＤ－Ｙ。将这两个载体共转染到带有报告基因的酵母细胞中。如果Ｘ和Ｙ存在相互作用，则将ＧＢＤ和ＧＡＤ联系到一起，恢复了ＧＡＬ４的转录功能，从而激活转录因子的表达［１”。该方法具有许多优点：①酵母是真核细胞，可以对表达的融合蛋白进行一些基本的修饰（如磷酸化等），表达的蛋白可在细胞核中产生交互作用。②其转化方法操作简单，转化率高，转化率可稳定在１０６个转化子／ｐｇＤＮＡ以上。③酵母能同时容纳龋种质粒，而且质粒的提取也较方便。④酵母菌有很多营养缺陷型标记，筛选比较方便。能够容易地获得所期望的阳性克隆，从ｃＤＮＡ文库和基因组文库中直接筛选出蛋白质问的相互作用成为它最具优势之处。⑤不需要纯化蛋白质。⑥检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。但是，该方法的假阳性率较高。而且，它并非对所有的蛋白质适用。因为融合蛋白的相互作用激活报告基因是在细胞核内发生的，所以表达的融合蛋白在细胞内能否正确折叠并被运至核内是检测蛋白之间有否相互作用的前提条件。因而不能被转运到细胞核内的蛋白质如细胞浆蛋白、细胞膜蛋白的相互作用就不宜使用该系统。尽管目前已在表达质粒中加入了核定位序列，但仍不能完全解决此类问题。同时由于酵母的后加工系统与哺乳动物细胞的后加工系统不尽相同，某些哺乳动物细胞的蛋白需经过翻译后加工才能相互作用，对这类蛋白质该系统也不适用。１０基于质谱分析的方法首先是串联亲和纯化（ＴＡＰ）的方法［１“。此方法的巧妙之处在于设计了一个双重的分子标签，包括了Ａ蛋白、ＴＥＶ蛋白酶切割位点、钙调素结合蛋白。将ＴＡＰ标签构建到诱饵蛋白上，然后在宿主细胞内表达融合蛋白，表达水平接近于诱饵蛋白的天然状态；可以与诱饵蛋白发生相互作用的其他蛋白质结合到融合蛋白上，形成复合体。细胞裂解物和ＩｇＧ基质温育在一起，通过Ａ蛋白复合体结合到ＩｇＧ上。冲洗后，加入ＴＥＶ蛋白酶，洗脱下复合体。在Ｃａ”存在的情况下，洗脱液与包被着钙调素的珠子共同温育，复合体就结合到珠子上。进一步洗去杂质后，加入ＥＧＴＡ螯合，复合体脱落。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离复合体各组分，胰酶酶切后，进行质谱分析。

万方数据