TBST缓冲液配制及使用方法

western-blot实验方法1、试剂耗材的准备：（1）转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl，39 mM 甘氨酸，0.037% SDS，20%甲醇）：（2）10 ×丽春红染液：（3）TBS 缓冲液：（4）TBST 缓冲液（含20%Tween20 的TBS 缓冲液）：（5）封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST 缓冲液）：（6）一抗、二抗及抗体稀释液：参照说明书，以封闭液或TBST 进行稀释。

（7）底物显色液ECL，4℃避光保存，现用现配。

（8）显影液和定影液用水稀释10 - 20 倍于铝盒中，可多次使用。

室温避光存放。

2、实验步骤：（1）蛋白样品制备：用细胞裂解液抽提蛋白，并测蛋白浓度。

（2）取1 mg 蛋白进行SDS-PAGE。

（3）转膜：（转膜缓冲液4 ℃预冷备用，冷却装置于- 80 ℃冰箱冷冻备用）。

（4）将2 张海绵垫、2 张滤纸、转膜夹子及玻棒浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

（5）戴上手套，剪一张与凝胶尺寸相近的PVDF 膜（83 mm × 75 mm），左上角剪一缺口作为标记，浸泡在盛有20 mL 甲醇的平皿中约15 sec，直到膜变半透明。

用纯水冲洗膜2 次。

浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

（6）SDS-PAGE 结束后，小心地剥下两块凝胶，一块用于考马斯亮兰染色观察电泳情况，另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。

海绵垫、滤纸、PVDF 膜及凝胶的预平衡时间在15 min - 1 hr 之间。

（7）将转膜夹子打开，使黑的一面保持水平。

按照海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸和海绵垫的先后顺序铺垫，制备凝胶转移夹层。

将膜与凝胶对齐。

用玻璃棒赶走气泡。

（8）将夹子夹起来，扣紧，小心不要移动内层。

放入电转槽中。

使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。

（9）将电转槽放在冰水盒中。

将预冻的冷却装置放入槽内。

缓慢倒入约650 mL转膜缓冲液。

（10）盖好盖子，接上电源。

根据蛋白分子量来调节工作电流，一般使用100 V（350mA），转移60 - 90 min。

TBSTtaetoweentbe————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：TBST是什么？TBST中含有Tris-Hcl，NaCl，tween20这三种物质，是做WESTERN BLOT 中常用的一种缓冲溶液T ris-B uffered S aline and T ween 20可作为缓冲液，也可作洗涤液（可用TBST洗NC膜）TBST洗涤缓冲液的全称试什么？TB S T是TB S+Tween的缩写，TB S是Tris-HCl缓冲盐溶液，为等渗盐溶液加Tris-HCl缓冲液用1N HCl调pH至7.4，Tween为一种非离子型去污剂，有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。

用途：Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途。

Tris被用于不同pH条件下的蛋白质晶体生长。

Tris缓冲液的低离子强度特点可用于线虫（C. elegans）核纤层蛋白（lamin）的中间纤维的形成。

Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一。

Tris也被用作滴定标准物。

作为蛋白缓冲液时，若后续工作需要质谱，则不适宜用Tris，最好换成其他质谱仪可耐受的缓冲液。

Tris中文别名：三(羟甲基)氨基甲烷;氨丁三醇;缓血酸铵;三羟甲基氨基甲烷;Tris;英文名称： Tris(hydroxymethyl)aminoethane分子式：C4H11NO3Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）TRIS是一种最常用的生物缓冲液，常配成PH值为6.8，7.4，8.0，8.8。

其PH值随温度变化很大。

温度每升高一度，PH值下降0.03,应注意温度对于Tris的pKa的影响。

1M TRIS-HCl 6.8和1.5M TRIS-HCl 8.8是SDS-PAGE最常用的试剂。

而由TRIS配成的TAE，TBE等是DNA电泳最常用的试剂，TE（PH8.0）主要用于溶解DNA。

分子生物学实验常用试剂配制分子生物学实验常用试剂配制(1) 0.01M PBS缓冲液：一袋粉制PBS缓冲液（中杉有售）加1000ml蒸馏水。

0.01M 磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。

(2) 0.01M枸橼酸盐缓冲液：一袋粉制枸橼酸盐缓冲液（中杉有售）加1000ml蒸馏水。

0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。

(3)1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl 调至pH8.0,加水至1000ml。

(4) 1‰DEPC水：1mlDEPC加入1000ml新鲜三蒸水中，剧烈震荡20分钟使充分混匀，37o C至少放置2h或过夜，HIRAYAMA HV-50高压灭菌器高温高压30分钟降解DEPC，4℃保存。

(5) 1%琼脂糖凝胶：取琼脂糖0.2g置烧杯中，加入20ml的1×TAE缓冲液，封闭锥形瓶口，放入微波炉内加热，不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液，待琼脂糖全部熔化后取出摇匀，冷却至60℃左右，加入10mg/ml溴化乙锭（EB）1μl，EB的终浓度为0.5μg/ ml，充分混匀。

将温热的凝胶倒入已经放好梳子的凝胶槽中，厚度约为3-5mm，注意不要有气泡，将凝胶放置室温待其自然凝固。

凝固后从胶槽中轻轻取出梳子。

(6)0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0，加水至1000ml。

(7) 50×TAE缓冲液：Tris碱242g，17.4mol/L冰乙酸57.1ml，0.5mol/L EDTA (PH8.0)100ml加蒸馏水至1000ml。

10×TBE缓冲液使用说明10×TBE缓冲液TBE 缓冲液是生物学中常使用的核酸电泳缓冲盐溶液，主要用于DNA 的琼脂糖凝胶电泳。

TBE的主要成分是Tris-硼酸盐与EDTA，缓冲能力强，适合较长时间电泳，分辨率较高，电泳小于1kb的片段时分离效果好。

TBE 缓冲液中的硼酸成分会影响DNA回收效率以及后续的酶反应，若要进行DNA片段的琼脂糖凝胶电泳回收实验，建议使用TAE 缓冲液。

储存条件: 室温储存，有效期至少12个月。

缓冲液其他试剂有：5×TBE 缓冲液10×TBE缓冲液50×TAE 缓冲液D-PBS缓冲液(不含钙镁和酚红)PBS缓冲液干粉1×PBS缓冲液(pH7.2- 7.4)10×PBS缓冲液 (pH7.2- 7.4)柠檬酸钠缓冲液0.01mol/L， pH6.0DNA退火缓冲液（5X）5×蛋白上样缓冲液（含DTT）4×蛋白上样缓冲液（含DTT）2×蛋白上样缓冲液（含β-巯基乙醇）2×蛋白上样缓冲液（含DTT）4×SDS-PAGE分离胶缓冲液(PH=8.8)4×SDS-PAGE浓缩胶缓冲液(PH=6.8)5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液10×电泳转移缓冲液（转膜液）Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝胶缓冲液2×Tris-Tricine-SDS-PAGE 上样缓冲液 (含DTT) 柠檬酸钠缓冲液0.1mol/L，pH4.5，无菌溶液1×PBST缓冲液，PH7.2-7.4，0.01M10×PBST20×PBS缓冲液， PH7.2-7.4，工作浓度0.01M pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液pH9.0磷酸盐-生理盐水缓冲液pH9.0碳酸盐-甘油缓冲液基础β-半乳糖酶洗涤缓冲液10× tris-mops缓冲液10×DNA上样缓冲液10×MOPS缓冲液TE缓冲液(PH=8.0)0.5M EDTA(PH8.0)20×TBS1×TBST缓冲液STE缓冲液（PH8.0）1×Tris-tricine-SDS-PAGE电泳缓冲液（阴极-）10×Tris-tricine-SDS-PAGE电泳缓冲液（阴极-）10×Tris-tricine-SDS-PAGE电泳缓冲液（阳极+）1×Tris-tricine-SDS-PAGE电泳缓冲液（阳极+）10×TBST缓冲液MES 2-(N-吗啡啉)乙磺酸PIPES 1,4-哌嗪二乙磺酸4×非变性蛋白上样缓冲液。