不同固定液对大鼠脾石蜡切片HE染色标本的影响_孙海梅

三种不同固定液对肺组织冷冻切片染色质量的影响发布时间：2023-02-14T07:14:46.592Z 来源：《医师在线》2022年9月18期作者：陈丽娟江徐程瑶梁莹莹毕嘉欣余学问[导读]三种不同固定液对肺组织冷冻切片染色质量的影响陈丽娟 江徐 程瑶 梁莹莹 毕嘉欣 余学问（深圳市中医院病理科；广东深圳 518000）【摘要】术中快速病理诊断在决定手术方式等方面的作用至关重要。

快速冷冻染色切片的质量好坏，直接影响病理报告的速度和准确性。

冷冻切片质量容易受到多种因素的影响，其中固定液的选择尤其重要，为了选择出肺组织最佳的固定液，本文选择了三种不同的固定液进行对比实验，经过几个方面的评判后，发现改良AFA固定液对肺组织冷冻切片染色效果最好。

【关键词】固定液；冷冻切片；HE染色；肺组织随着临床科室手术的发展，要求送检手术中病理诊断的病例逐年增多，术中快速病理诊断不仅可判定病变的性质，还决定了患者手术的方式，其作用至关重要。

快速冷冻染色切片的质量好坏，直接影响病理报告的速度和准确性，这要求病理技术员能够熟练掌握冷冻病理切片技术，为病理医师快速诊断提供优质的冷冻切片。

冷冻切片质量容易受到多种因素的影响，其中最为重要的是冷冻切片固定液的选择，为了选择出肺组织最佳的固定液，本文选择了三种不同固定液进行对比实验。

1 材料与方法1.1 材料收集2022年3-5月深圳市中医院病理科临床手术新鲜肺组织15例。

1.2 方法对冷冻切片进行固定、HE染色、对比染色质量。

①取材：临床医师进行组织取材，组织块大小薄厚适宜，一般切取2 cm×2 cm×0.3 cm。

②包埋：在样本托上加少量OCT包埋剂，使其预冷呈半凝固状，把组织块平放于其上，在组织周围滴加适量的OCT将组织包埋。

③冷冻切片④固定：将冷冻切片立即分别放入三种不同固定液内进行固定1 min。

⑤HE染色：苏木素液染色2 min，饱和碳酸锂溶液蓝化后流水冲洗，放入醇溶性伊红染色10-25 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

实验名称：大鼠前列腺病理切片制作与HE染色一、实验操作取前列腺右侧叶，4%中性多聚甲醛溶液固定，24h后常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋，用组织切片机将组织块切为5μm厚的切片，60℃恒温箱中烤片6h后，二甲苯脱蜡，逐级酒精脱蜡，苏木精染色，流水冲洗，盐酸、酒精分化，流水冲洗15min，逐级酒精脱水至95%酒精，酚红染色，流水冲洗，95%酒精，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察一般的病理组织学变化并摄影。

二、病理结果评分标准HE染色光镜观察前列腺组织：病理观察项目为前列腺组织腺体管腔、腺体分泌物、前列腺间质炎症细胞浸润、纤维组织增生和总得分等5项。

病理结果评分标准光镜检查，病理观察项目为前列腺组织腺体管腔、腺体分泌物、前列腺间质炎细胞浸润、纤维组织增生和总分等5项，其分级及评分标准如下：①腺体管腔正常：腺上皮为单层柱状或立方状，腺体管腔扩大，皱襞较多(0分)。

轻度缩小：腺体管腔稍变小，皱襞稍减小(2分)。

明显缩小：腺泡萎缩，腺体管腔变小，甚至闭塞，皱襞明显减少或消失(4分)。

②腺腔分泌物多(正常)：腺体管腔内有大量深粉红染分泌物，有的形成前列腺凝结物(0分)。

减少(轻度)：腺体管腔内粉红染色分泌物稍有减少(2分)。

明显减少(重度)：管腔分泌物减少，分泌物淡红色，甚至有的无分泌物(4分)。

③炎细胞浸润基本正常：炎细胞偶见或无(0分)。

轻度：少量炎细胞散在浸润(3分)。

重度：大量炎细胞浸润，有的可见多核巨噬细胞形成炎性肉芽肿性病变(6分)。

④纤维组织增生基本正常：偶见极少量纤维组织增生或无(0分)。

轻度：少量纤维组织增生(3分)。

重度：大量纤维组织增生(6分)。

⑤总分是上述4项得分之和。

四、实验数据。

HE染色实验报告篇一：he染色与免疫组织化学染色实验报告华中农业大学动物科技动物医学院he染色与免疫组织化学染色实验报告1 实验目的及意义1.1了解石蜡切片的制作过程1.2 掌握he染色与免疫组织化学染色的基本原理以及染色方法1.3 熟悉he染色与免疫组织化学染色后的读片知识2 实验方法及步骤2.1 石蜡切片制作及he染色步骤2.1.1取材与固定：从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。

2.1.2脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。

再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。

2.1.3浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。

待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。

冷却凝固成块即成。

包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。

2.1.4切片前的准备工作：先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡块，块两边必须切成平行的直线。

将玻片擦洗干净后均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油，放置冰箱备用。

2.1.5切片与贴片：将预冷的蜡块固定于切片机上，调节切片厚度为6微米，切成薄片。

切下的薄片往往皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。

2.1.6 脱蜡至水华中农业大学动物科技动物医学院二甲苯ⅰ20分钟，二甲苯ⅱ20分钟，无水乙醇3分钟，95％酒精3分钟，80％酒精3分钟，70％酒精3分钟，自来水洗5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.1.7染色：苏木素液7分钟，自来水洗5分钟，1％盐酸溶液分化30秒，自来水洗5分钟，1％氨水返蓝10秒，自来水洗20分钟，95％酒精3分钟，1％伊红酒精溶液2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

1、用颈椎脱臼法处死小鼠，75%的酒精浸泡2-3分钟，减少毛发所造成的污染。

2、将小鼠移入超净工作台内，无菌条件下，以仰卧位固定在解剖盘上。

3、用眼科镊子夹起腹股沟中线处皮肤，用眼科剪做一横切口。

用镊子捏住切口两端的皮肤朝着小鼠的尾部和头部纵向撕开皮肤，暴露腹腔膜壁，用乙醇消毒。

4、切开腹腔壁膜，用镊子夹住脾脏，并用剪子剪去与其相连的组织。

HE染色石蜡切片制作的基本过程作者：未知来源：生物秀时间：2007-12-71、取材与固定：从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液等)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。

2、脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。

再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。

3、浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。

待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。

冷却凝固成块即成。

包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。

4、切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。

切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。

5、脱蜡染色：常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。

苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。

伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。

染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。

HE染色过程是：①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。

大鼠脑组织石蜡切片的免疫组化染色体会【摘要】脑组织石蜡切片的染色结果，易出现切片染色不清楚，脱片、假阳性，假阴性出现。

免疫组化这些结果的出现，与组织固定，抗原修复，内源性过氧化物酶活性的灭活，抗体质量，显色试剂质量，苏木素质量，时间上的把握及技术人员熟练程度有关，得出了免疫组化的过程的很多细节及各个步骤的主要的注意事项，提高脑组织切片的免疫组化染色操作技术。

【关键词】脑组织；石蜡切片；免疫组化；染色随着免疫组化技术广泛应用于科学和医学各个领域的研究和诊断中，免疫组化的技术已经成为一种基本的检测技术，如何提高免疫组化的技术，特别是脑组织切片在免疫组化中的检测，是每一个科研人员在检测中最关心的问题，现将近几个月大鼠脑组织切片的免疫组化技术的一些体会和细节概况如下：1 脑组织固定体会用4%的多聚甲醛固定，固定之前要保持脑组织的平整和完整，不能被挤压，以免影响细胞的形态，影响电镜下观察。

2 脑组织防脱片的处理（1）传统的防脱片的处理方法有延长烤片的时间、提高烤片的温度和重新脱水［2］。

免疫组化前，切片在58-60℃的恒温箱中烤2-24 h［1］，在脱蜡和脱水过程中，把切片稍晾干后再行下一步的免疫组化过程。

但不能进行高温烤片，在干燥的条件下加热切片可以加速组织中抗原的氧化而破坏组织中的抗原［2］。

（2）玻片进行化学试剂处理玻片为充分洗净干燥的磨砂防脱载玻片。

可以选用免疫组织化学染色中常用防脱片剂即多聚-l-赖氨酸(poly-llysine)对载玻片进行处理，处理后载玻片不易脱片。

3 抗原修复（1）少数抗体可以选择酶消化法.如原位末端标记法（tunel）试剂盒中以蛋白酶k为消化酶，在这过程中，注意蛋白酶k的浓度不能过高，过程中不能超过10 min，以免修复太过出现假阴性，且bps洗涤要彻底。

（2）热修复注意事项。

高压加柠檬酸盐(ph6. 0)缓冲液修复，时间为5分钟，冷却后连续修复2次。

水浴锅修复时水温为95℃，修复时间为15～60 min。

石蜡切片、HE、免疫组化实验一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈）①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。

将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。

）②脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。

使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡Ⅰ1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡Ⅱ中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。

③包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡Ⅱ倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。

），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。

HE染色注意事项：1.染色时PH值的调节是很重要的，有时组织块在多聚甲醛中固定时间过长往往使组织酸化而影响细胞核的着色，因此切片入水后，转入饱和碳酸锂水溶液中处理10－30分钟，这样可使细胞核着色较好。

2.用伊红染色切片时，往往在经脱水的低浓度酒精时极易脱色，特别是对于细胞密集的组织更明显，这时可在脱水至95％酒精1后，再以95％配制的1％伊红液中复染3－5分钟，然后脱水透明，可以获得满意的效果。

3.苏木精染色后，分色是至关重要的，应该在显微镜下进行。

一般以细胞核染色比较清晰，细胞质等基本无色为宜。

如发现过染，可以延长分色时间，若染色太浅，则应重新进行染色后再分色，总之必需分色至细胞核清晰而背景基本无色才能往下进行。

4.切片经酒精脱水后，如在转入二甲苯时有混浊现象产生或呈白色不透明状态，此为脱水不彻底，应立即将切片退回无水酒精重新脱水，如再不透明时则应更换无水酒精。

1、切片在脱蜡后出现大片白色的斑点（图1）原因：由于烤（烘）片温度太低，玻片在脱蜡前没有充分烤（烘）干；切片在二甲苯停留时间不足，或二甲苯使用过久，造成脱蜡不尽。

对策：如果玻片是由于没有烤（烘），先用无水乙醇处理去除玻片上的水分，然后重新用二甲苯脱去石蜡。

如果烤（烘）干不足的现象比较严重，可能导致切片脱落，则无法补救。

如果白色斑点是由于切片在二甲苯停留时间不足造成，或使用的二甲苯过久，切片则需退回到二甲苯停留时间相对长些，或更换二甲苯，脱色、漂白、重新染色。

2、细胞核染色苍白、暗淡，即苏木精染色太淡（图2）原因：此类问题可能有3个影响因素，切片在苏木精染色液停留时间太短；苏木精染色液过度氧化，失去染色能力，不能再继续使用；分化步骤处理时间过长。

如果是骨组织细胞核暗淡，则多数是由于脱钙过度造成。

对策：切片重新染色。

如果组织在酸性固定液如Zenk2er、Bouin及非中性缓冲甲醛液固定时间过长，细胞核染色能力将减弱，须增加其在苏木精染色液的时间，或用一些方法增加组织的嗜碱性，以改善细胞核的着色。

根据6种固定溶液长时间固定对热冻切片制片效果影响引言在生物医学研究中，热冻切片制片是非常重要的技术之一，可以用于观察细胞和组织的形态以及分析其结构和功能。

在进行热冻切片制片时，固定溶液的选择和固定时间的控制对于制备高质量的切片非常关键。

本文旨在探讨不同固定溶液在长时间固定过程中对热冻切片制片效果的影响。

方法在本研究中，我们使用了6种常用的细胞和组织固定溶液，包括A、B、C、D、E和F。

为了比较不同固定溶液的效果，我们选择相同类型的细胞和组织样本，并将其分别放置在不同的固定溶液中。

每个样本在不同固定溶液中固定的时间也有所不同，包括15分钟、30分钟、1小时、2小时和24小时。

在固定完成后，我们使用标准的热冻切片制片方法对每个样本进行制片。

这包括将固定样本处理为冰冻切片，利用切片机制备切片，并将切片染色以观察细胞和组织的结构。

我们对每组样本制备的切片进行了评估和比较，包括切片质量、组织结构的保留程度以及染色的均匀性等指标。

结果根据我们的实验结果，不同固定溶液在长时间固定过程中对热冻切片制片效果有显著影响。

以下是我们的主要发现：1. 对于样本A和B，固定时间的延长对切片制片效果没有显著影响。

无论固定时间为15分钟还是24小时，切片的质量都非常好，组织结构完整保留，染色均匀。

2. 对于样本C和D，固定时间的延长对切片制片效果有一定影响。

随着固定时间的延长，切片的质量稍有下降，组织结构的完整性略有损失，但染色效果仍然良好。

3. 对于样本E和F，固定时间的延长对切片制片效果有显著影响。

固定时间过长会导致切片质量明显下降，组织结构的完整性丧失，染色效果不均匀。

讨论在长时间固定过程中，选择合适的固定溶液对于热冻切片制片效果至关重要。

根据我们的实验结果，不同样本对固定溶液的敏感性也有所不同。

样本A和B对固定时间不敏感，而样本E和F对固定时间非常敏感。

根据本研究的结果，我们可以得出以下结论：1. 对于固定时间不敏感的样本，可以选择相对较长的固定时间以确保切片质量和组织结构完整性。

常规HE染色质量控制摘要：病理切片染色质量控制是一个多环节、多步骤的过程。

组织离体后从取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色全过程，其中某一环节出现问题均会影响切片的质量，而苏木素、伊红染色在切片过程中是关键的一个环节，首先，要配制好试剂，苏木素要变成真正的染料，氧化是关键的一步。

苏木素在氧化过程中，氧化剂量的控制对苏木素是非常关键[3]，氧化不足或未经过氧化的苏木素染色能力差，氧化过度，表面一层氧化膜，易引起切片污染和操作不便。

苏木素染液的配制在加入冰醋酸要适量，适量的加入抑制了苏木素对胞浆的着色力，加多了会影响细胞核着色，加少了引起核浆共染。

同时，在日常工作中把工作制度化，加强学习，现代病理技术已经不是单纯的大体标本和普通的he染色切片制作，而是多学科相互渗透，相互影响，综合性理论、技术性都很强的学科技术。

关键词：he染色质量控制【中图分类号】r9【文献标识码】b【文章编号】1671-8801（2013）03-0284-01苏木精和伊红染色方法，简称he染色方法，是生物学和医学的细胞和组织学最广泛用的染色方法。

he染色是石蜡切片最基本的染色方法，优质的he染色仍是临床病理诊断最可靠的依据。

组织制片过程中，组织需经过取材、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后，he染色多种环节技术操作，制作一张优质的he染色切片，是每个病理实验技术人员必须掌握的一项基本技能。

1材料与方法1.1材料。

组织块10%中性福尔马林（na2hpo46.5g，nah2po44g，40%甲醛10ml，加水至1000ml调至7.0ph）无水乙醇、95%乙醇、80乙醇、丙酮、二甲苯、石蜡、苏木素染液、1%盐酸酒精、伊红染液等。

1.2方法。

常规组织处理。

①标本接受时，认真核对申请单与送检单是否一致，符合要求方可接受[1]，让送检人及接受人签字；②固定：标本离体后要及时固定（30min内），10%中性福尔马林，固定液量为组织块4-5倍，可达15-20倍，大块组织固定时间24小时（或以上），小块组织4-6小时；需把标本全浸在固定液中。

《中国组织工程研究》Chinese Journal of Tissue Engineering Research文章编号:2095-4344(2019)34-05492-055492www.CRTER .org·研究原著·孙良，男，1981年生，山东省莱西市人，汉族，主治医师，主要从事重症感染、组织病理学研究。

通讯作者：徐林，工程师，山东省立第三医院中心实验室，山东济南市250000文献标识码:B稿件接受：2019-05-09Sun Liang,Attending physician,Department of Critical Care Medicine,Shandong Provincial Third Hospital,Jinan 250000,Shandong Province,China Corresponding author:Xu Lin,Engineer,Central Laboratory,Shandong Provincial Third Hospital,Jinan 250000,Shandong Province,China三种小鼠眼球组织石蜡切片固定液固定效果的比较孙良1，徐林2(山东省立第三医院，1重症医学科，2中心实验室，山东省济南市250000)DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1414ORCID:0000-0003-0308-8426(孙良)文章快速阅读：文题释义：石蜡切片：组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法，石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已被相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。

教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。

活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。

几种固定液在冰冻切片中的染色效果分析【摘要】目的冰冻切片是一种在低温下使组织快速冷却，进行切片的一种方法，现在多应用于外科手术中快速病理诊断。

影响制片质量的因素诸多，固定就是其中之一，为了在短时间内制作出一张高质量的冰冻切片，固定液的选择显得尤为重要。

通过对4种固定液在冰冻切片中的染色效果进行对比分析，以筛选出对冰冻切片最适合的固定液，提高组织切片的染色效果。

方法选取四种使用频率较高的固定液，对63例乳腺组织标本冰冻切片组织进行固定，将固定后的冰冻切片进行HE染色，对染色结果进行对比分析。

结果使用甲醇固定液固定后，细胞形态显示一级、二级和三级的比例分别为92.1%、7.9%和0.0%，和其他三组两两比较，优势明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；甲醇固定液固定后组织的染色效果优于其他三组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

结论甲醇固定液对冰冻组织切片固定后，对细胞形态的影响小，且染色后细胞形态基本正常无明显收缩，胞浆胞核对比显著，染色效果理想。

【关键词】固定液；冰冻切片；HE染色冰冻组织切片染色对于临床病理学诊断有重要辅助价值[1]，选择不同的固定液对组织进行固定后，组织染色效果也不同程度的受到影响[2]。

为了将不同固定液在冰冻组织切片中的染色效果进行对比分析，筛选理想的固定液，提高HE染色的效果，笔者选取了常用的四种固定液对63例乳腺组织标本的冰冻切片进行固定处理，固定后进行HE染色，具体报告如下：1 资料和方法1.1临床资料收取63例乳腺组织标本，包括正常乳腺组织8例、导管原位癌11例、浸润性乳腺癌组织标本23例和乳腺肌瘤标本21例。

1.2固定液：AFA液（95%乙醇85ml、浓甲醛10ml、冰醋酸5ml）、95%乙醇、丙酮、甲醇（95%乙醇45ml、甲醇45ml、冰醋酸10ml）1.3方法1.3.1取材及切片大小为1.5m*1.5cm，厚2-3cm的新鲜乳腺组织，挤少许普通胶水放入冷冻组织托盘上，将胶水底层冷却变硬后，将组织块放在变硬的胶水上，再涂适量胶水覆盖在组织上30s，用冰冻锤使其快速冷却。