RT-PCR引物设计原则和方法
近刚开始做PCR，参考了很多与引物设计相关的帖子，结合自己使用primer5和oligo的体会，想
谈谈自己设计引物的方法和步骤，恳请各位前辈指正。
RT-PCR引物设计原则和方法
在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入
框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。
此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp。
点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包
括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’端不要以A结尾，最好是G或者C，
T也可以；3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游
引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结
构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在
该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这
些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要
求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影
响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，
但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5。
在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。
在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经
被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。
在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定
位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。
Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括
引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G。3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双
链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。
Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析
上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower，即上下游引物
之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物
存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不
要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整
个引物的二聚体图示和Delta G值。
Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。
Analyze中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比
例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差
太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm值可以控制在50～70度之间。
第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不
如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使错误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过
100幅度若不大的话，也可以接受。
Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明
此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。
引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中
已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G窗口，可以
保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。
引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的
同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基
因的同源序列就可以。
有一个问题，引物设计原则里面常常强调，引物所对应模板序列的Tm 值最好在72℃左右，但是
软件里面Search出来的引物，很少有达到这个值的，一般都在50～65度之间，这是什么原因？软件怎么没有限定这个规则？
补充
PCR引物设计的黄金法则
1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通
过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2. 引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）
