高效液相色谱柱的故障分析

高效液相色谱仪使用中常见问题及对策高效液相色谱（HPLC）作为一种分离技术和方法，目前已经发展到一个全新的阶段。

高精度的输液泵，应用广泛的色谱分离柱，低噪音、高灵敏度的各种检测器和功能强大的数据处理软件系统的出现，都推动了液相色谱技术的迅猛发展。

液相色谱仪正以它分辨率高、分析速度快和应用广泛的优点倍受仪器分析工作者的青睐，广泛地应用于医药卫生、环境监测、食品检测等领域。

作者本人从事液相色谱分析工作二十多年，应用HPLC技术在血药浓度、生物胺、核苷酸、蛋白质浓度测定等实际工作中，积累了许多的方法和经验，在这里与大家交流，希望能对同行们有所帮助和借鉴，共同促进液相色谱分析技术的发展。

1高效液相色谱仪的基本工作原理高效液相色谱仪如图1所示，是由溶液贮器、高压泵、进样系统、色谱分离柱、检测器和数据处理系统几部分组成。

高压泵从溶液贮器中抽走流动相，流经整个仪器系统，形成密闭的液体流路。

样品通过进样系统注入色谱分离柱，在柱内进行分离。

柱流出液进入检测器，使已被分离的组分逐一被检测器收集，并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰，通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算[1]。

液相色谱仪是依靠色谱柱进行分离的。

研究证明：物质的色谱过程是指物质分子在相对运动的两相（液相和固相）中分配“平衡”的过程。

液相色谱是以具有吸附性质的硅胶颗粒为固定相，各种洗脱液为流动相。

当液体样品在载体流动相的推动下，在液-固两相间作相对运动时，由于各组分在两相中的分配系数（K）不同，则使各自的移动速度不同，即产生差速迁移。

各组分在两相间经过多次分配，从而达到使混合物分离的目的。

上式反映了物质在两相中进行吸附、解吸、再吸附、再解吸…过程中，由于在两相中浓度的不同，而存在分配系数上的差异。

既然分配系数及其差异是引起组分在液相色谱柱分离的根本原因，那么，必然地也会同色谱理论中可测宏观量之间存在着某种定量关系，事实上，色谱理论中通常用容量因子k’的概念来反映物质在两相中的分配关系：k’值可以非常方便地表达组分在两相的分配，又很容易从色谱实验数据中直接测得，是色谱理论中重要的基本参数之一[2]。

液相色谱柱使用问题解析液相色谱柱使用疑难问题解析就液相色谱柱的安装，使用和维护知识，以及各种柱压、峰形和色谱柱寿命等问题前来提问，也欢迎液相色谱方面的高手前来交流切磋。

内容提纲：一、液相色谱柱的安装、启用和维护中的重点注意事项1、柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配2、溶剂的匹配转换3、新柱使用前的平衡和老化4、pH使用范围5、色谱柱的保存二、柱压问题1、填料破碎和使用后，有填料粉末生成2、颗粒物堵塞引起柱压上升和对策1）预防措施2）故障排除3、化学污染物引起柱压上升和对策1）预防措施2）故障排除三、峰形问题1、峰后拖2、峰前延3、其他峰形问题四、保留时间问题1、保留时间的重现性2、保留时间漂移3、柱与柱之间的重现性4、批与批之间的重现性五、寿命问题六、其他疑难的色谱技术问题一.安装、启用和维护中重点注意事项色谱柱既是液相色谱仪的最核心部件，价格相对昂贵，请牢记它是高档仪器中的高档部件，给它以足够的尊重和关怀。

如避免强烈的碰撞和震动，尽管色谱柱从1米高的实验台掉落到水泥地上不至于100%会损坏，但50%的可能损坏你也承受不起。

另外不要让柱床变干，避免在严寒环境受冻等。

1. 柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配色谱柱是消耗品，不是仪器原配的情况很多。

上图表明柱连接的6种不同方式（数字单位是英寸），如果两者类型不匹配将会产生漏液或者死体积过大的现象。

接头比柱头深度长，不易拧紧而漏液；接头比柱头深度短，柱头内留有空隙而产生死体积，使谱带展宽和峰拖尾。

2. 溶剂的匹配转换色谱柱内保存溶剂和仪器系统内存留溶剂，如果和流动相不匹配，使用前需进行转换。

特别是流动相含缓冲盐时，如保存溶剂是纯有机相或有机相比例高，直接将新柱接入使用，会导致缓冲盐在柱内结晶析出，最严重会将新柱永久不可逆地损坏。

正相柱保存溶剂一般为正己烷，如果要转换成HILIC柱模式使用，由于正己烷和甲醇乙腈的互溶性不好，转换中间需用二氯甲烷或乙酸乙酯过渡。

高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法诊状(一)保留时间变化可能的原因: 解决方法1.柱温变化:柱恒温2.等度与梯度间未能充分平衡:至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够:用>25mmol/L的缓冲液4.柱污染:每天冲洗柱5.柱内条件变化:稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命:采用保护柱(二)保留时间缩短可能的原因: 解决方法1.流速增加:检查泵,重新设定流速2.样品超载:降低样品量3.键合相流失:流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向4.流动相组成变化:防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加:柱恒温(三)保留时间延长可能的原因: 解决方法1.流速下降:管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化:用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.键合相流失:同前(二)34.流动相组成变化:同前(二)45.温度降低:同前(二)5(四)出现肩峰或分叉可能的原因: 解决方法1.样品体积过大:用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强:采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道:更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效:更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏:更换进样器转子(五)鬼峰可能的原因: 解决方法1.进样阀残余峰:每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物:处理样品3.柱未平衡:重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六)基线噪声可能的原因: 解决方法1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声:更换氘灯4.电干扰(偶然噪声) : 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡:流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾可能的原因: 解决方法1.柱超载:降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰:清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4 : 同前(四)45.同前(四)3 5. : 同前(四)36.死体积或柱外体积过大:连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降:用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八)峰展宽可能的原因: 解决方法1.进样体积过大:同(四)12.在进样阀中造成峰扩展:进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢:设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大:设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高:增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大:用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长:等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大:将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载:进小浓度小体积样品液相色谱柱使用及保养液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。

液相色谱常见问题及处理方法HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法1、样品量不足，解决办法为增加样品量2、样品未从柱子中流出。

可根据样品的化学性质改变流动相或柱子3、样品与检测器不匹配。

根据样品化学性质调整波长或改换检测器4、检测器衰减太多。

调整衰减即可。

5、检测器时间常数太大。

解决办法为降低时间参数6、检测器池窗污染。

解决办法为清洗池窗。

7、检测池中有气泡。

解决办法为排气。

8、流动相流量不合适。

调整流速即可。

为什么HPLC柱柱压过高柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。

其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。

1、拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查（在安装了保护预柱的情况下）；2、把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，若压力仍高则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；3、将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。

这时，如果柱压仍不下降，再检查；4、更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。

若柱压还高，请与厂商联系。

液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？1、筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。

2、存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子如何解决HPLC进行分析时保留时间发生漂移或急速变化漂移现象1、温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定2、流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等3、柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡快速变化现象1. 流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定2、泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。

3、流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合HPLC 仪器问题1、我的HPLC泵压明显的偏高，请问可能的原因？答：流速设定过高；流动相或进样中有机械杂质，造成保护柱、柱前筛板或在线过滤器阻塞；流动相粘度过大；柱温过低；缓冲盐结晶；压力传感器故障。

８ 　２００５．０５高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法陈莲 高洪 肖啸（云南农业大学动物科学技术学院，云南　昆明　６５０２０１）高效液相色谱（ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，　ＨＰＬＣ）技术是近３０年发展起来的一种具有高灵敏度、高选择性的高效快速分离分析技术。

它既能用于微量组分的分析测定，又能用于大量的制备分离，手段灵活多样，其应用范围已超过其它各种分离方法，尤其在生化医药样品的分析分离、食品卫生安全检验等方面更能充分发挥它的特长，为推动这些领域的进步和发展作出了巨大贡献。

液相色谱在使用过程中常会出现一些影响分析结果的小问题，如果使用人员了解了常见问题及其成因和相关解决方法，能做到早预防勤维护，使分析结果保持较好的稳定性与较高的精确性。

１　液相色谱仪系统液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。

对于整个系统而言，色谱柱、泵和检测器是核心部件同时也是容易出事故的主要部件。

２　常见问题及解决方法２．１ 针对柱压问题柱压变化是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的指标，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效高低、分离效果及保留时间等密切相关。

所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在５０ＰＳＩ（针对Ｗａｔｅｒｓ高效液相色谱仪）之间。

压力过高、过低及波动较大都属于柱压问题，但柱压的高低与色谱柱的种类、品牌、液相系统本身及使用的流动种类相关。

值得注意的是在使用梯度洗脱进柱压的平稳缓慢的变化是允许的。

一般而言，柱压变化最先考虑的是柱子，在排除柱子因素后再考虑其它因素。

　在实际应用中常见柱压问题可从以下几个方面来考虑（见表１）。

２．２ 针对保留时间漂移的问题保留时间的改变是很多液相色谱仪使用者常碰到的问题，包括了保留时间的延长或缩短。

它的产生与很多因素有关，可从以下方面进行考虑（见表２）。

图１ 液相色谱仪工作系统及流程２００５．０５ ９更换新的色谱柱。

液相色谱柱柱压低原因1.柱床老化：柱床材料在使用一段时间后会逐渐老化。

老化的柱床表面会发生变化，导致样品流动性能下降，从而影响柱压。

这种情况下，需要更换柱床。

2.颗粒堵塞：在柱内使用的颗粒可能会出现堵塞，导致流动阻力增加，从而降低柱压。

可能的颗粒堵塞原因包括样品残留、溶剂中存在的杂质以及柱床老化等。

要解决颗粒堵塞问题，可以尝试使用洗脱液进行反流洗脱，或者使用压力更高的洗脱系统。

3.柱温过高：柱的温度对柱压也有很大的影响。

如果柱的温度过高，溶剂中的溶解气体会释放出来，从而降低柱压。

这种情况下，可以降低柱的温度或者更换柱床材料。

4.色谱柱连接不紧密：柱连接部分的密封性不好可能会导致柱压低。

检查连接处是否有漏气现象，如果有，可以更换连接件或者适当调整连接紧度。

5.溶剂浓度过高：柱压的大小与溶液的浓度有关，溶液浓度过高会导致柱压下降。

在溶剂比例方面，可以尝试使用更高比例的有机溶剂来提高柱压。

6.流量过低：流量对柱压也有很大的影响。

如果流量过低，那么在柱内流动的样品压力会下降，从而导致柱压低。

可以尝试增加流量来提高柱压。

7.A/D转换器故障：柱压过低可能是由色谱仪的A/D转换器故障引起的。

这时需要检查色谱仪的硬件部分，如果需要，可以更换A/D转换器。

总的来说，液相色谱柱柱压低可能是由柱床老化、颗粒堵塞、柱温过高、柱连接不紧密、溶剂浓度过高、流量过低或A/D转换器故障等多种原因导致的。

在解决柱压低的问题时，可以根据具体情况逐个排除可能原因，并采取相应措施来解决问题。

近年来，岛津液相色谱仪在科学研究和工业生产中得到了广泛的应用。

然而，随着使用时间的增长，液相色谱仪也可能会出现一些常见故障，这些故障有些对实验结果产生了很大的影响。

深入了解液相色谱仪的常见故障及其维修方法对于科研工作者和技术人员来说是至关重要的。

**1. 压力不稳定问题**在使用岛津液相色谱仪时，有时可能会遇到压力不稳定的问题。

这可能会导致色谱柱的寿命缩短，影响分离效果。

该问题出现的主要原因可能有色谱柱堵塞、柱温控制不稳定、进样器堵塞等。

解决该问题的方法有清洗色谱柱、调节柱温、清洗进样器等。

**2. 噪声干扰问题**另外，噪声干扰也是岛津液相色谱仪常见的故障之一。

噪声干扰可能会导致谱图产生异常，严重影响实验结果。

出现噪声干扰的原因可能有进样器堵塞、溶剂气泡、泵的脉动等。

解决该问题的方法包括排除气泡、改善进样器的清洗方法、调节泵的流速等。

**3. 回路漏液问题**回路漏液也是岛津液相色谱仪常见的故障之一。

回路漏液会导致进样器稀释效果不佳，影响实验结果。

回路漏液的原因可能有连接处松动、密封圈老化等。

解决该问题的方法包括更换密封圈、重新调整连接处的紧固度等。

**4. 泵的压力不稳定问题**液相色谱仪泵的压力不稳定也是一个常见的故障。

泵的压力不稳定可能会导致进样量不准确，影响分析的准确性。

出现这一问题的原因可能有泵的柱塞磨损、密封圈老化等。

解决该问题的方法包括更换柱塞、更换密封圈等。

总结回顾，液相色谱仪在实验过程中可能会遇到各种故障，如压力不稳定、噪声干扰、回路漏液和泵的压力不稳定等。

解决这些故障需要技术人员有较强的实操能力和丰富的经验。

除了平时的维护保养，定期的维修和保养也是至关重要的。

只有不断改进维护的技术和方法，才能更好地保障液相色谱仪的正常运行。

个人观点及理解：对于液相色谱仪的维护保养我一直非常重视，我认为只有定期的检查和维护才能延长仪器的使用寿命，保证实验结果的准确性。

在解决液相色谱仪常见故障时，需要及时沟通和协作，找出问题的根源并采取有效措施加以解决，这样才能确保实验的顺利进行。

高效液相色谱法一．仪器的维护与常见问题处理若液相出现规律性基线波动，长时间不平稳可能原因是什么？快速解决方法：一般为仪器系统出现气泡，最好使用纯甲醇长时间冲洗系统（不少于3小时，特殊情况要12小时左右）柱压逐渐升高可能原因是什么？快速判断①色谱柱出现堵塞②针座堵塞③进样针出现堵塞④系统管路中有未冲洗干净的盐⑤滤芯脏了解决方法①色谱柱出现堵塞：一种是将堵塞了色谱柱的位置拆卸，取出里面的筛网用水或甲醇超解（不建议采用，除非没有其他方法）另一种是将堵塞一头色谱柱链接在仪器上另一头不要链接，先用10%甲醇根据色谱柱柱压调节流速冲洗一小时左右，然后换成纯甲醇再以此方法继续冲洗，根据其柱压随时调整流速。

②针座堵塞与进样针出现堵塞：情况不严重则将它们拆卸后用水超解几分钟就可以了，若堵塞严重只有更换新的（堵塞不代表不能用，若无明显的质量损坏如：变形，滑口，开裂等，后续修好后还能做备件使用）③系统管路中有未冲洗干净的盐：用水或10%异丙醇对系统冲洗，冲洗后柱压正常，则可正常使用。

（注意不建议对系统反冲洗，会造成管路中的残留盐类物质重新回到系统中造成二次堵塞。

）④滤芯脏了：更换滤芯若出现保留时间飘移可能原因是什么？快速判断原因：①流动相混合不均匀②柱温不稳③压力不稳④密封圈松动⑤对于是四元泵的液相，其比例阀区域有堵塞情况（流动相是按比例配置，若比例阀区域堵塞，进样第一针时，可能有一个阀只进入25%另一个阀则是75%，进样第二针时则会变成一个阀进入20%，另一个阀80%）快速解决方法：①流动相重新配置，并按要求混匀②保证环境温度与仪器设定温度相差不大并稳定③系统冲洗平衡后方能实验④更换或调整密封圈⑤将出现堵塞区域的设备进行超声清洗。

1.气相检验化学残留：对照品重复性必须符合要求，但供试品重复性不做要求（上海海尼是对照品重复性必须符合要求，但配置两个供试品，各进一针不计算重复性。

目前海陵是对照品与供试品都要计算重复性）液相进样针无法正常采集?解决方法：一般为仪器机械故障，若进样器显示信号一直为红色，可能是进样针损坏或机械臂故障。