质粒的提取

质粒DNA提取细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。

目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，碱裂解法是最为常用的提取方法。

其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。

原理：用SDS和NaOH处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA 和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。

由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH 值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。

十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。

在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。

再由苯酚/氯仿 /异戊醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。

碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。

试剂配制及作用机理1. 溶液ⅠpH 8.0: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA。

葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA是Ca2＋和Mg2 ＋等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。

从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。

2.溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。

使用的时候需现配。

要新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。

NaOH是最佳溶解细胞的试剂。

不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。

用不新鲜的0.4 M NaOH，即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。

SDS是离子型表面活性剂，它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜；b解聚细胞中的核蛋白；c能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。

SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。

3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。

pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA 复性，且稳定存在。

溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。

前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。

4.苯酚/氯仿 /异戊醇（25：24：1）PDS沉淀的形成并不能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行乙醇或异丙醇沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。

这里用25:24:1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的。

酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，因此酚必须用pH8.0的Tris水溶液进行平衡，一方面是让水饱和酚，减少后续处理时溶液中水的损失，另一方面市面上出售的酚通常是酸性的，DNA在酸性条件下能溶解有机相，此外苯酚经pH8.0的Tris平衡后上层必须留一部分Tris水溶液，以减少苯酚被空气中的氧气氧化，氧化后的酚会变成粉红色。

平衡的方法：在68度水浴中使苯酚充分溶解，加入8-羟基喹啉至终浓度0.1%（8-羟基喹啉呈淡黄色，氧化后无色，用以指示酚是否发生氧化），加入等体积的1M tris-HCL （pH8.0），搅拌15分钟，静置分层后，除去上层水相，重复两遍，最后使用pH试纸确认pH大于7.8，除去大部分水相后（一般酚层上的水相为1c m高度）4℃存于棕色瓶。

由于酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。

至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。

5.乙醇、异丙醇沉淀DNA乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，同时乙醇与核酸不起化学反应，因此是理想的沉淀剂。

加入乙醇后，乙醇会夺去DNA周围的水分子，DNA失水聚合。

回收后的水相含有足够多的盐，一般实验中，是加2-2.5倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占70%左右。

异丙醇性质和乙醇类似，但它沉淀核酸能力比乙醇更强，如果使用异丙醇只需要加入0.7倍体积。

在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。

如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇洗涤，就能得到好的样品。

异丙醇沉淀：优点：所需体积小，沉淀速度快缺点：易使盐类与DNA共沉淀，异丙醇难以挥发去除，通常需要用70%漂洗几次。

乙醇沉淀：体积大，对盐类沉淀少，易挥发去除，沉淀能力低。

在沉淀核酸时必须有一定的盐如Li，Na，NH4+，其目的是屏蔽核酸上的磷酸基团，防止沉淀时的静电排斥力6. TE或水TE溶液：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。

用TE溶解核酸会比较稳定，短时间内储存也可以用水溶解DNA。

7： RNase A 使用浓度20ug/ml（实验室经常配制成20mg/ml）。

核糖核酸酶A是内切核糖核酸酶，可特异地攻击RNA上嘧啶残基的3'端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。

利用RNase A消化RNA并不能去除RNA，只是将RNA水解成50-70bp的小片段。

在使用RNaseA消化RNA时如果发现DNA也被降解，说明里面有DNase污染，可以通过煮沸的方法去除DNase污染。

实验室常用试剂盒：康为世纪高纯度质粒小提试剂盒 CW0500操作步骤1. 取1-5 ml 过夜培养的菌液，加入离心管（建议2ml EP管）中，8000 rpm 离心3分钟（12000rpm一分钟也可），尽量吸弃上清。

注意：质粒拷贝数较低或>10kb时，可以通过二次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，同时后续所加试剂Buffer P1、P2及N3的量需加倍。

2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl Buffer P1（先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。

3.向离心管中加入250 μl Buffer P2（如出现浑浊，放37℃培养箱加热待其澄清后再使用），温和地上下颠倒混匀4-6次，使菌体充分裂解。

此时菌液应变得清亮粘稠。

所用时间不应超过5分钟，以免质粒受损伤。

注意：不要剧烈震荡，以免造成所提质粒中基因组DNA污染。

如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。

4. 向离心管中加入350 μl Buffer N3，立即温和地上下颠倒混匀4-6次，此时出现白色絮状沉淀。

12,000 rpm 离心10分钟。

注意：Buffer N3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。

室温放置时间不宜超过5分钟，以免损伤质粒。

5. 将步骤4中的上清转移到已装入收集管的吸附柱（Spin Column CM）中，12，000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6.(推荐步骤）向吸附柱中加入500 μl Buffer PB，12,000 rpm ，离心30-60秒，倒掉吸附柱中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10 等），此步可省略。

如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21， HB101，JM101， ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步，如果提取低拷贝质粒推荐采用此步。

7. 向吸附柱中加入700 μl Buffer PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm 离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收收集管中。

8. 向吸附柱中加入500 μl Buffer PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm 离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收收集管中。

9. 12,000 rpm离心2分钟，倒掉废液。

将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的Buffer PW去除，Buffer PW中乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR 等）。

10. 将吸附柱置于一个新的1.5mlEP管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-100 μl Buffer EB，室温放置2 -5分钟（使质粒充分溶解水里），12,000 rpm 离心1 分钟，将质粒溶液收集到离心管中。

-20℃保存质粒。

注意事项：1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤10Buffer EB在65－70℃水浴预热，适当延长吸附和洗脱的时间，可以增加提取效率。

2）洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。

若用水做洗脱液，应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内(可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围)，pH 值低于7.0会降低洗脱效率。

洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。

去内毒素质粒提取内毒素，即脂多糖或LPS，是革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）细胞膜的组成部分。

细菌外膜的外层脂质部分是完全由内毒素分子所构成的。

细菌在其活性生长期向其周围微环境中散布少量的内毒素，在死亡时则释放大量内毒素。