荧光定量PCR实验数据分析教材

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问题1：无 Ct 值出现
检测荧光 信号的 步骤有 误: 一 般 SG 法采用 72℃ 延伸时 采集。 引物或探 针降解: 可 通过 P AGE电 泳检测 其完整 性。 模板量不 足: 对未知 浓度的 样品应 从系列 稀释样 本的最 高浓度 做起。 模板降解: 避 免样品 制备中 杂质的 引入及 反复冻 融的情 况。
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问题5：重复性差
1.加样不准确。 2.仪器在样品上温度条件有差异，即温度均一性不好。 3.模板浓度低。样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。
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问题6：熔解曲线只有上升支
扩增产物 的Tm值 较高， 设置熔 解曲线 时改9 5 度为99 度。
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95℃，10min； 95℃，15sec， 60℃，30sec， 72℃，30sec， 反应结束后，立即进行溶解f曲or线4分0 析cy。cles
95℃，15sec， 60℃，60sec， 95℃，15sec， 60℃，15sec。
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第五部分：数据分析
授发明了具有划时代意义的 PCR技术。
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PCR Polymerase Chain Reaction
vPCR (聚合酶链式反应)技术是一种体外快速扩 增特定DNA片段的方法。
v 是一个在引物介导下反复进行热变性、退火、 引物延伸三个步骤而扩增DNA的循环过程。
v运用PCR技术能快速特异地扩增所希望的目的 DNA片段，使皮克(Pg，10－12）起始物达到 微克（μg，10－6）水平。
2 -△△CT
表示实验组目的基因表达相对于对照组变化的倍数。
ΔCt =Ct 目的- Ct 内参 ΔΔCt = ΔCt实验组- ΔCt 对照组

案例三：病原体检测
总结词
荧光定量PCR在病原体检测中具有高灵敏度和特异性，能够快速准确地检测出极低浓度 的病原体。
详细描述
针对病原体特异性基因序列设计引物和探针，通过荧光定量PCR技术对临床样本进行扩 增和检测。这种方法在传染病诊断、食品安全检测等领域具有广泛应用，能够为疾病预
防和控制提供有力支持。
模板制备
将提取的DNA进行浓度测 定和调整，确保其浓度符 合荧光定量PCR的要求。
引物设计与合成
根据目标基因序列，设计 特异性引物，并进行合成 。
荧光定量PCR反应
反应体系配置
将PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、引 物、DNA模板等按照比例加入PCR管 中。
循环参数设置
荧光信号检测
在PCR仪中进行荧光信号的实时检测 ，记录荧光信号的强度和循环数。
案例二：突变检测
总结词
荧光定量PCR是突变检测的有效手段，能够快速准确地检测DNA序列中的点突变、插入或缺失。
详细描述
针对目标基因的特定区域，设计包含突变信息的引物或探针，通过荧光定量PCR扩增后，利用熔解曲 线或高分辨率溶解分析等技术，判断是否存在突变。这种方法在遗传性疾病诊断、癌症研究等方面具 有重要应用。
荧光定量PCR的原理
• 在PCR反应过程中，随着DNA的扩增，荧光染料或荧光探针会 与新合成的DNA结合，产生荧光信号。荧光信号的积累与DNA 的扩增数量呈线性关系，通过荧光信号的实时监测，可以精确 地计算出起始模板的浓度。
荧光定量PCR的应用
• 荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体 检测和基因分型等领域。通过实时监测PCR反应进程，可以 精确定量目标基因的表达水平，检测基因突变，以及鉴定病 原体种类和基因型等。

荧光信号检测
使用荧光检测仪器，实时监测PCR扩 增过程中的荧光信号变化。
数据分析
对荧光信号数据进行处理和分析，计 算目标基因的相对表达量或拷贝数， 并评估实验结果的可靠性和准确性。
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荧光定量PCR的应用
基因表达分析
基因表达分析
荧光定量PCR可用于检测特定基因在不同组织或不同生长条件下的表达水平，帮助研究者了解基因的功能和调控 机制。
缺点
成本高
荧光定量PCR需要特殊的仪器和试剂 ，尤其是荧光探针，这使得它的成本 相对较高。
操作复杂
相对于常规PCR，荧光定量PCR的操 作步骤更为复杂，需要更多的实验技 能和经验。
可能出现假阳性
由于荧光定量PCR的灵敏度极高，有 时可能会出现非特异性扩增或污染导 致的假阳性结果。
无法检测基因突变类型
引物、DNA模板和酶
根据实验需求，加入适量的引物、DNA模板和酶，确保PCR 反应的正常进行。
PCR扩增
循环参数
设置适当的PCR循环参数，如变性、退火、延伸等温度和时间，确保PCR扩增的 效率和特异性。
扩增产物检测
在PCR扩增过程中，实时监测荧光信号的变化，以确定扩增产物的量。
荧光信号的检测与数据分析
表达的基因等方面非常有用。
实时监测
通过在PCR反应过程中连续监测 荧光信号，可以实时跟踪DNA的 扩增情况，从而精确控制PCR的
进程。
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特异性
由于使用的是TaqMan或类似的 探针技术，荧光定量PCR具有很 高的特异性，可以有效地避免非 特异性扩增。
通量高
通过多通道检测，可以在一次实 验中检测多个基因或样本，大大 提高了实验的通量。

实时荧光定量PCR介绍
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质粒标准品构建流程
目的基因
PCR
目的基因
目的基因克隆
目的基因
基因组DNA 质粒
质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 22
体外转录RNA标准品构建流程
目的基因
4/5/2024 • 12
RT Primer的选择
• Random Primer • Oligo dT Primer • Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-Primer PCR R-Primer
实时荧光定量PCR介绍
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RT Primer的选择
Random
目的片段在mRNA任何位
5’
目的片段
3’ 置都能使用。通常mRNA
F
R
Random
表达量分析最适。
5’
目的片段
AAA··· 3’ 适用于mRNA表达量分析，
F
R
提升反应检测的灵敏度。
1,500 base
OOligligooddTTPPrirmimeer r 目的片段在距Poly(A) Tail
Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同
普通PCR引物 目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚 体要求不严格。
Real Time PCR引物 目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异 性反应和引物二聚体要求严格。