基因芯片技术及其应用简介(精)

基因芯片技术及其应用简介

生物科学学院杨汝琪

摘要:随着基因芯片技术的发展,基因芯片越来越多的被人们利用,它可应用于生活中的方方面面,如:它可以应用于医学、环境科学、微生物学和农业等多个方面,基因技术的发展将有利于社会进一步的发展。

关键词:基因芯片;技术;应用

基因(gene是载有生物体遗传信息的基本单位,存在于细胞的染色体(chromosome上。将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上,称之为基因芯片(又称DNA 芯片、生物芯片。在一块1 平方厘米大小的基因芯片上,根据需要可固定数以千计甚至万计的基因片段,以此形成一个密集的基因方阵,实现对千万个基因的同步检测。基因芯片技术是近年来兴起的生物高新技术,把数以万计的基因片段以显微点阵的方式排列在固体介质表面,可以实现基因检测的快速、高通量、敏感和高效率检测,将可能为临床疾病诊断和健康监测等领域,带来全新的技术并开拓广阔的市场。

1 基因芯片技术原理及其分类

1.1基因芯片的原理:

基因芯片属于生物芯片的一种"其工作原理是:经过标记的待测样本通过与芯片上特定位置的探针杂交,可根据碱基互补配对的原则确定靶序列[1],经激光共聚集显微镜扫描,以计算机系统对荧光信号进行比较和检测,并迅速得出所需的信息"基因芯片技术比常规方法效率高几十到几千倍,可在一次试验中间平行分析成千上万个基因,是一种进行序列分析及基因表达信息分析的强有力工具。

1.2基因芯片分类:

1.2.1根据其制造方法可分原位合成法和合成后点样法;

1.2.2根据所用载体材料不同分为玻璃芯片!硅芯片等;

1.2.3根据载体上所固定的种类可分为和寡核苷酸芯片两种;

1.2.4根据其用途可分测序芯片!表达谱芯片!诊断芯片等

2 基因芯片技术常规流程

2.1 芯片设计根据需要解决的问题设计拟采用的芯片,包括探针种类、点阵数目、片基种类等。

2.2 芯片制备将DNA, cDNA或寡核昔酸探针固定在片基上的过程。从本质上可分为两大类fz} ,一类是在片基上直接原位合成,有光蚀刻法、压电印刷法和分子印章多次压印法三种;另一类是将预先合成的探针固定于片基表面即合成点样法。

2.3 样品制备常规方法提取样品总RNA,质检控制。再逆转录为。DNAo

2.4 样品标记在逆转录过程中标记荧光素等。

2.5 芯片杂交标记的cDNA溶于杂交液中,与芯片杂交。

2.6 芯片扫描一用激光扫描仪扫描芯片。

2.7 图像采集和数据分析专用软件分析芯片图像,然后对数据进行归一化,最后以差异为两倍的标准来确定差异表达基因。

2.8 验证用定量PCR或原位杂交验证芯片结果的可信性。

3基因芯片合成的主要方法

目前已有多种方法可以将基因片段(寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。这些方法总体上有两种:

3.1原位合成:

此方法主要为光引导聚合技术,它不仅可用于寡聚核苷酸的合成,也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平板印刷技术与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法,技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽阵列提供了一条快捷的途径。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基(视所要固定的分子为核酸或寡肽而定并与保护基建立共价连接;

3.2点样合成:

此方法在多聚物的设计方面与原位合成相似,合成工作用传统的DNA或多肽固相合成仪完成,只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子,通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等。

4基因芯片技术的应用

4.1 在基础研究中的应用

4.1.1 基因表达分析

同一组织细胞在不同的发育阶段,不同的外界环境因素影响下,其基因的表达模式不同,同一个体的不同组织器官的基因表达模式也不同。如何研究众多基因表达与否及其表达丰度是人们关注的一个焦点问题。传统的方法一次只能研究某个基因的表达情况,远不能满足这一要求,而基因芯片技术由于具有高并行性、高通量的特点正适合于此研究。芯片杂交在对基因表达进行分析中能够从很少的样品提供有关基因表达差异表达的信息,对疾病的诊断、治疗和药物筛选有促进作用。

4.1.2基因组测序

基因组测序芯片技术中杂交测序技术和邻堆杂交技术都能进行高效快速的

测序。基因芯片技术用于测序提出的较早,Chee等利用 135000个探针的阵列对人类线粒体基因组测序,准确率达99%以上。

4.1.3发现新基因

寻找和发现新基因是各学科研究的主要任务之一。传统的分子生物学方法如差异显示 PCR、代表性差异分析法、消减杂交、抑制性消减杂交等以各自独特的设计策略,有效地发现了许多相关的新基因。但这些方法大多局限于对单个或几个基因的分析,无法阐明某一生物过程或某一病理生理过程中多基因的复杂作用及其相互调控关系,还存在有如所得序列往往是部分片段、对一些低丰度的基因不易发现、操作步骤繁琐费时、假阳性率较高、重复性差、特异性不高、低通量等不足,且受 PCR、电泳分辨率等条件的限制。基因芯片技术高通量、高灵敏度、自动快速、并行性的特点,在新基因发现中能克服传统方法的一些不足,能以极少量的样品,自动化地并行分析数以万计的基因在不同时空上的表达模式和变化,能满足多基因参与调控的复杂过程,能以各自不同的研究策略,灵活地设计不同的微阵列来大规模、快速地对成千上万的基因进行平行筛选,找出有差异表达的基因,能大大提高对新基因发现的效率和可能。

基因芯片技术的诸多优点:被检目标 DNA 密度高、样品用量极少、自动化程度高、便于大量筛选新基因等,使得发现新基因的速度大大提高。Sche na等对T细胞相应与 17 个阵列成分的c DNA 测序发现 3 个新基因。4.1.4突变体和多态性的检测

基因芯片技术还可规模地检测和分析 DNA 的变异及多态性。G uo等利用结合在玻璃支持物上的等位基因特异性寡核苷酸(ASO s微阵列建立了简单快速的基因多态性分析方法。将 ASO s共价固定于玻璃载片上,采用 PCR 扩增基因组 DNA 其一条引物用荧光素标记,另一条引物用生物素标记,分离两条互补的DNA 链,将荧光素标记DNA链与微阵列杂交,通过荧光扫描检测杂交模式,即可测定 PCR 产物存在的多种多态性,该方法对人的酪氨酸酶基因第 4 个外显子内含有的 5 个单碱基突变进行分析,结果显

示单碱基错配与完全匹配的杂交模式非常易于区别。这种方法可快速、定量地获得基因信息。

4.1.5基因文库作图 :

采用高密度 DNA探针阵列和相应的生化与信息学方法进行基因组文库克隆排序,该方法对基因组文库中每一个克隆,都可以检测出一个特征性序列标记物,而每一对克隆中,在标记物之间相似性基础上,测量其相对重叠部分,利用该重叠信息,即可连续性地将文库排列成重叠图谱。

4.2在医学中的应用

4.2.1 疾病诊断

目前,基因诊断是基因芯片中最具有商业价值的领域。许多疾病都与基因相关,传统的基因诊断方法往往只能对单个或少数几个基因进行检测,效率低且准确性差,利用基因芯片技术高速、并行、集成化程度高和灵敏度好等特点,可以实现对该疾病的快速、简便、高效的诊断。

4.2.2 药物筛选和药物开发

由于芯片技术具有高通量、大规模、平行性等特点,可以进行新药的筛选,尤其在对中药成分的真伪鉴定及有效成分的筛选、药理研究、化学药物的合成等方面具有重要的作用。而且用基因芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验,缩短药物筛选所用时间;还可以利用基因芯片技术来寻找药物靶标,查检药物的毒性或副作用,从而在基因组药学领域带动新药的研究和开发。

4.2.3 避免遗传病的发生

目前知道有 600多种遗传病与基因有关,妇女在妊娠早期用 DNA 芯片做基因诊断,可以避免许多遗传疾病的发生。

4.2.4 法医鉴定

在法医学方面,DNA芯片比早先的 DNA 指纹鉴定更进一步,它不仅可以做基因鉴定,而且可以通过 DNA中包含的生命信息描绘生命体的脸形、长相和外貌特征。此外,基因芯片在病原体诊断、器官移植、细胞抑制方面等方面也有应用。

4.2.5药物研究

基因芯片在药物研发中的作用有以下几个方面:

①人类基因组芯片在一定程度上代替人体靶组织,为待测药物提供了理想

的研究对象;

②芯片可以用来分析代谢途径和信号调节通路。例如通过研究在某种药物

作用下,机体药物代谢过程相关基因的表达变化,进而对所有上调和下调

的基因的全面研究,能够发现一些新的信号调节通路,这些新的调节通路则为新药开发提供了思路;

③可以确定药物作用相关的靶组织,预测药物的副作用,进而通过对不同

组织的药物选择性试验,使药物的副作用减少到最小程度;

④引导医药开发如疫苗和抗菌素的研发。使用c DNA 芯片研究发现了脑膜

炎淋球菌在和宿主表皮细胞接触后表达增高的 189个基因,其中4

4%的功能是编码细胞表面蛋白,这项研究成果为开发预防脑膜炎

淋球菌感染的相关疫苗提供了可选择的靶位点;

⑤当传统检测方法难以追踪药物本身或者药物的临床效果显现的间期较长

时,通过基因芯片检测特定被诱导的基因(药品代谢相关的基因,

可以为预知药效及药物临床使用剂量提供一种简便的途径。

4.2.6 疾病的基因诊断

随着基因芯片使用范围的增加,其在疾病的早期诊断、分类、指导预后和寻找致病基因上都有着广泛的应用价值。在癌症的诊断上,医生们通常依靠检测一些基因和蛋白质的表达变化水平来进行诊断。通过基因芯片技术对这些基因的检测,可以对以上疾病进行准确的早期诊断。基因芯片技术还可用于病原菌的鉴定,通过构建多种细菌的抗原决定簇和毒力因子的基因芯片,可以用于诊断临床上不明确的感染性疾病的感染源。除上述应用外,基因芯片技术还可以应用在新的病原菌的鉴定,流行病学调查及微生物的衍化进程等方面。

4.2.7基因芯片技术在创伤骨科研究领域的应用

骨创伤的修复也涉及多个基因及复杂的信号转导机制l,基因芯片能够同时对多个基因组群的表达进行研究,这一特点使其在骨创伤修复研究中具有其他研究方式所不具备的优势。在骨的愈合过程中,力学环境、血管发生和成骨作用的相互依赖性亦被Fang等,通过生物芯片技术在基因表达水平加以证实。而雌激素通过复杂的代谢过程参与骨折愈合过程,对雌激素相关基因的研究是了解这一复杂机制的必要条件。Hatan。等[”]对骨折愈合过程中的雌激素相关基因进行表达谱分析,发现有52个相关基因在卵巢切除的大鼠中下调,但在给子雌激素后恢熨其中尿激酶纤溶酶原激活子在骨折大鼠模型的软骨与骨连接部位有-活化软骨细胞和破软骨细胞的功能,提示u一PA在愈合组织的再吸收和改建过程中具有重要的作用。

4.2.8基因芯片技术在输血医学中的应用

基因芯片技术的快速发展,对输血医学事业发展产生巨大的影响,其应用潜

力将给21世纪的输血医学事业带来历史性的变化。基因芯片技术现在已应用于医学各个领域。基因芯片技术在输血医学中的应用,包括血液制品的病毒性指标的检测与保存、血型鉴定、血液成分单采、输血相关性疾病诊断与治疗以及目前存在的问题。如:利用基因芯片技术进行血液不同血型间的转化,甚至“创造”新血型。