光合细菌的分离及培养条件研究
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光合细菌M-01的分离及培养条件研究
[摘要]从湛江市霞山区海滩表层污泥中富集分离出红假单胞菌属光合细菌M-01,对其培养条件进行了初
步探讨,结果表明:菌株生长温度为30e时,最适培养光照度为3 000 lx。培养基正交试验结果表明其最优
培养基配方为:氯化铵2 g,磷酸氢二钾0.2 g,乙酸钠4 g,碳酸氢钠2 g,氯化钠1 g,酵母膏0.15 g,硫酸镁
0.2 g,T.M储液少量,蒸馏水1 000 mL;其中乙酸钠为最大影响因子。
[关键词]光合细菌(PSB);分离;培养;正交试验
光合细菌(Photosynthetic bacteria)是一类光合自养型古老细菌,具有较强的分解有机物特性,光合
细菌作为水质净化剂广泛应用于水产动物如一些经济鱼类、虾蟹、贝类的养殖和育苗中[1~4]。在生产上有
意义的红螺菌科包括红螺菌属、红假单胞菌属和红微菌属[4]。现已有学者对红假单胞菌的分离、鉴定、培
养特性及保藏做了研究[5~7],但还没有关于其营养条件优化的报道。笔者从海洋环境中分离到了光合细
菌M-01,采用正交试验方法进行了培养条件优化的研究。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
(1)待分离材料 取广东省湛江市霞山区海滩表层污泥。
(2)培养基 使用红螺菌科富集培养基作为富集分离基础培养基[8]。
1.2 方法
(1)菌株的分离筛选方法 取污泥10 g,装入500 mL细口无色玻璃瓶中,加入富集培养液至满,盖上
瓶盖,隔绝空气,于30e, 3 000 lx光照下进行富集培养3~4 d,培养液呈绛红色后,取富集培养菌液1
mL,转接入培养液中,重复以上操作2次,然后采用改良的Hungate厌氧培养技术)))柱滚管法[9]进行
分离纯化,用分离培养基的琼脂柱穿刺培养后保存。
(2)细胞色素光谱吸收峰值测定方法 培养物离心后洗涤,将细胞悬浮于60%的蔗糖溶液中,采用
722S分光光度计扫描,波长范围为340~1 000 nm。
(3)生长量的测定 为比较不同培养条件下(光照、接种量、营养条件)培养物生长量的差别,采用
722S分光光度计检测培养物D660 nm值。
(4)光照度对菌株生长影响的测定 将已接种的光合细菌培养液于温度30e,光照度分别为2
000、
3 000、4 000、5 000、6 000 lx下培养3 d,每组3管,用722S分光光度计测定培养物菌液光密度D660 nm(用 培养初刚接种的培养液为空白对照)。
(5)酵母膏添加量对菌株生长影响的测定 在培养液中分别加入酵母膏,令其质量分数分别为0100、
0105、0110、0115、0120、0125、0130 g/L。
(6)培养基正交试验 根据预备试验,设计5因子4水平的正交试验(表1),在温度30e,3 000 lx光
照条件下进行培养基的正交试验。
#72#
长江大学学报(自科版)2005年8月第2卷第8期/农学卷第25卷第3期
Journal of Yangtze University(Nat Sci Edit)Aug. 2005 Vol12 No18 /Agri Sci V, Vol125
No13表1 培养基正交试验因素水平
Table1 Factor levels of orthogonal experiment
of the culture mediag/L
水平A
氯化铵
B
磷酸氢二钾
C
乙酸钠
D
碳酸氢钠
E
酵母膏
1 015 011 210 015 0105
2 110 012 310 110 0110
3 115 013 410 115 0115
4 210 014 510 210 0120
2 结果与分析
2.1 菌株形态特征及培养特征
共分离纯化菌株5株,记为M-01、M-02、M-
03、M-04、M-05,均为棕红色菌落,培养特征类
似,M-01株生长速度较快,以其做以下试验。
菌株M-01幼龄呈短杆状,不形成丝状体,细
胞大小(016~019)Lm@(112~210)Lm。芽生
分裂,分裂时产生哑铃状的菌体。鞭毛染色,可见
极生鞭毛。
在光照厌氧液体培养中繁殖速度快,培养液
起初呈浑浊状,淡黄色,后来逐渐出现絮状物,转变为浅红色,最后呈深红色。在琼脂平板上菌落呈圆形,
边缘整齐,表面凸起,光滑湿润,棕红色。
2.2 菌株的最大吸收波长
图1为光合细菌活细胞的吸收光谱。由图1可见,活细胞的吸收峰位于380、500、535、590、805、860
nm等处,最大吸收波长为380 nm。光合细菌在380、805、860 nm处具有吸收,表明光合细菌含有细菌叶
绿素a,在500、590、535 nm处具有吸收,表明光合细菌的活细胞中还含有类胡萝卜素[10]。活细胞吸收峰
值表明M-01具有光合细菌典型吸收特征。
图1 光合细菌活细胞吸收光谱
Figure1 The optical density of M-01living cells
2.3 菌株的鉴定
根据上述试验结果,又依据红假单胞菌属Rhodopseudomonas的形态、生理生化特征[10],初步确认菌株
M-01为红假单胞菌属Rhodopseudomonas中的一种。
2.4 光照度对菌株生长的影响
图2为不同光照条件下光合细菌M-01的光密度。由图2可见,在温度30e,3 000~5 000 lx时,该
光合细菌均保持旺盛的生长势头,在实验培养中发现,4 000~5 000 lx光照条件下生长迅速,菌液迅速转
红,但是细胞老化较快,易出现破碎细胞附壁现象,因而认为3 000 lx是该光合细菌的适宜光照度。
2.5 培养基中酵母膏添加量对其生长的影响
图3为不同酵母膏添加量时光合细菌M-01培养48 h的光密度。由图3可见,添加酵母膏对菌株生
长有明显的促进作用,但是当酵母膏添加量为011 ~ 013 g/L时,光合细菌培养48 h时菌液光密度值差
别不大,由于酵母膏同时有促进其它菌类生长的作用,为减少杂菌污染的机会,结合生产中降低成本的要
求,笔者认为酵母膏添加量为0110 ~ 0115 g/L是合适的。
#73#农学卷第25卷第3期操玉涛等:光合细菌M-01的分离及培养条件研究 图2 光合细菌M-01在不同光照度下的光密度
Figure2 The optical density of the
photosynthetic bacteria M-01
图3 不同酵母膏添加量时M-01培养48 h的光密度
Figure3 The optical density of48h M-01liquid
with different yeast paste contents
表2 正交试验结果
Table2 The results of orthogonal experiment
编号
各因素水平
氯化铵
A
磷酸氢二钾
B
乙酸钠
C
碳酸氢钠
D 酵母膏
E
D660 nm
1 1 1 1 1 1 01189
2 1 2 2 2 2 11670
3 1 3 3 3 3 11584
4 1 4 4 4 4 11868
5 2 1 2 3 4 11513
6 2 2 1 4 3 11834
7 2 3 4 1 2 11050
8 2 4 3 2 1 21093
9 3 1 3 4 2 21068
10 3 2 4 3 1 21236
11 3 3 1 2 4 11229
12 3 4 2 1 3 11802
13 4 1 4 2 3 21381
14 4 2 3 1 4 21222
15 4 3 2 4 1 11765
16 4 4 1 3 2 11179
X111328 11538 11108 11316 11571
X211623 11990 11687 11843 11492
X311834 11407 11992 11628 11900
X411887 11736 11884 11884 11708
R01559 01583 01884 01568 01408
2.6 培养基优化
从表2极差R值可以看出,5因
素影响光合细菌生长的主次顺序是:
C>B>D>A>E,因素C乙酸钠对光
合细菌生长的影响十分明显,因素E
酵母膏对生长的影响最小。根据表4
均值大小,最佳培养基配方组合为
A4、B2、C3、D4、E3,综合以上结果,本
试验菌株的最佳培养基配方及培养条
件为:氯化铵2 g,磷酸氢二钾012 g,
乙酸钠4 g,碳酸氢钠2 g,酵母膏011
g,硫酸镁012 g,氯化钠1 g,T1M储
液少量,蒸馏水1 000 mL,培养温度
30e,光照3 000 lx。
3 结论与讨论
光合细菌M-01在光照厌氧液体
培养中繁殖速度快,培养液起初呈浑
浊状,起初为淡黄色,以后转变为浅红
色,最后呈深红色。该光合细菌菌株
在30e连续光照条件下生长迅速,较 少发生附壁和产生细胞碎片,34e以
上时细胞附壁和产生细胞碎片明显增多,25e以下生长速度低,因此25 ~ 30e为较适宜的生长温度。
本试验分离的光合细菌M-01在3 000 lx左右的光照度下,很短时间即进入对数生长期,经过36 h,
菌液颜色棕红色,表现出了较高的生长活性。经过20亿年的进化,光合细菌已能在水圈生态系多个子生
态系中生活,表现出很强的适应能力,这与光合细菌代谢能力的多元化是分不开的,因此,不同生态环境中
的光合细菌对营养物质的利用必然存在差别.
本试验从红螺菌科光合细菌富集培养基[9]出发,得到了现有光合细菌菌株M-01的最适培养培养条
件,说明了对特定的种类而言,最适培养条件会有差异。在适宜的培养条件下,光合细菌可保持较好的生
#74# 长江大学学报(自科版) 2005年8月长活性,有利于生产及保藏。
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