蛋白质工程制药--EPO1

实验四 含目的蛋白ERAF17菌种活化及药品配制
【实验目的】：掌握菌种活化过程，熟悉无菌操作过程
【实验原理】：菌种活化就是逐级扩大培养，是为了得到纯而壮的培养
物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。菌种发酵有一般需要
2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所
以要活化,让菌种逐渐适应培养环境。
蛋白质工程试验项目
实验一 聚丙烯酰胺凝胶电泳制备 实验二 豌豆植物可溶性总蛋白提取及电泳 实验三 豌豆蛋白凝胶电泳后染色、脱色及观察 实验四 含目的蛋白ERAF17菌种活化及药品配制 实验五 BL21-ERAF17 目的蛋白基因的检测 实验六 目的蛋白ERAF17的诱导表达及蛋白处理 实验七 目的蛋白质电泳、染色、脱色及对比观察
溶液成分
总体积 5ml
总体积 10ml
总体积 15ml
总体积 20ml
总体 积 25ml
总体积 30ml
15%
水
1.1ml 2.3ml 3.4ml 4.6ml 5.7ml 6.9ml
30%丙烯酰 2.5ml 5.0ml 7.5ml 10.0ml 12.5ml 15.0ml 胺
1.5MTris(pH 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 8.8)
入胶板中赶走气泡，使其凝固。 4）在PCR产物中加入5ul loadingbuffer后混匀。 5）选择DNA2000 marker 为标准上样。 6）PCR产物上样。 7）在紫外凝胶成像系统中观察实验结果。
实验六 目的蛋白ERAF17的诱导表达
【实验目的】：熟悉细菌液体培养过程，掌握诱导原核生物表达外源蛋 白的原理及方法 【实验原理】：目的基因ERAF17 克隆在PET-28载体上，控制该基因的 启动子为诱导型启动子需要在培养基中加入乳糖类似物IPTG目的基因才 会表达，加入IPTG一定时间后目的蛋白在细胞中不断的积累，一定时间 后表达量最大。 【实验设备及药品】：37度恒温摇床、移液器、恒温水浴锅、IPTG。 【实验步骤】： 1．挑取含有目的基因ERAF17的单菌落，接种于5 ml LB培养液中（含 50 µg/ml，卡那霉素），37 ℃振荡培养过夜 2．取过夜培养液按1:100的比例扩大培养。 3．在OD600值0.6-0.7时取1 ml菌液收集菌体备用。取完菌液后，在培养 液中加入IPTG至终浓度1.0 mmol/L进行诱导，经不同的诱导时间（1 h， 2 h，3 h，）后取1 ml培养物收集菌体。 4．将收集的所有菌体用1×蛋白上样缓冲液重悬，100 ℃ 8-10min后离 心，取上清备用。

• 干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干 扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干 扰素的抗病毒活性为106 U/mg，只相当于天然 产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的β-干 扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存 在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发 现，β-干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17位、 31位和141位），推测可能是有一个或几个半胱 氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位 的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸， 结果使大肠杆菌中生产的β-干扰素的抗病性活性 提高到108 U/mg，并且比天然β-干扰素的贮存 稳定性高很多。
1.1774年舍勒研究软锰矿时，偶然发现黄绿色气体。 2.很遗憾，受错误学说影响,他认为是氧化物。 3.1810年，由戴维最终确定其为单质。 舍勒 (1742～1786)瑞典化学 4.氯气的发现到确认为一种新的元素组成的单质，时 间长达三十多年。 5.舍勒（1742-1786），瑞典化学家，44岁去世； 戴维（1778-1829），英国化学家，以电解法研究氯 气、碱金属、碱土金属闻名， 52岁时死于肺部疾病。
案例再现
“果林氯气泄漏案”：1999年10月淮阴县果林乡一个体废 品收购站在切割一废弃的氯气钢瓶时造成氯气泄漏，使 得果林小学30 多名师生中毒。当时情况如图：
风向 西
泄漏点
较高堤坝
果林 小学
洼地
南
问题：若让你指挥果林小学师生疏散，你将怎样指挥以 避免这场灾难？你的依据是什么？
[科学史话]
请阅读P83“科学史话”－“氯气的发现和确 认”，你从这一史实中得到什么启示？
地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;
（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包 括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；

❖
1.重组DNA的快速裂解与鉴定
❖
2.限制性内切酶图谱分析法
❖
3.核酸分子杂交方法进行鉴定
❖
4.PCR扩增方法进行鉴定
23
表:
一、原核表达体系 二、真核表达体系
1.酵母表达体系 2.昆虫表达体系 3.哺乳类动物细胞
24
概论
❖ 1.蛋白质工程:崛起的缘由、概念 ❖2.常用技术：定点诱变（ 概念、意义） ❖ 3.蛋白质改造范围 ❖ 4.改造类型
❖ 分析工作主要有两个方面： 一方面—建立正常生理条件下机体、组织、细胞的全部蛋白质
的图谱和数据库，获得蛋白质组群的整体信息，为进一步的分析
工作提供基础；
另一方面—比较分析非生理条件下蛋白质组所发生的变化。7
研究目标的动态性
❖ 组成有机体的所有不同细胞都共享一个 基因组，即一个有机体只有一个确定的基 因组。
17
人工染色体
酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome,YAC）
细菌人工染色体（BAC） 噬菌体人P1衍生的人工染色体（PAC） 哺乳动物人工染色体（MAC）
18
限制性内切酶酶切
切:
酶切
19
接:
目的基因
基因重组
基因载体
重组体(复制子)
20
连接方法
❖ 1.粘性末端的连接
❖ 但基因组内各个基因的表达条件、程度 都要随时间、地点、环境的不同而不同。 所以，蛋白质组是一个动态的概念。
8
体现生命的复杂性
❖ HGP表明：30亿对碱基，仅编码2.6-3.9万个不同的基因。 人类的复杂性体现在表达产物的复杂性，即蛋白质的复杂性。
❖证 明
★一个基因并不只存在一个相应的蛋白质，可能有几个或几十个。 ★基因也不能直接决定一个功能蛋白。 ★很多疾病并不完全是因为基因改变所造成，基因的表达方式错综

蛋白质工程的崛起
蛋白质工程的概念
享学课堂
是研究蛋白质的结构及结构与功能的关系，然后人为 地设计一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去 改变其基因结构，从而产生新的蛋白质。 或者从蛋白质结构与功能的关系出发，定向地改造天 然蛋白质的结构，特别是对功能基因的修饰，也可以 制造新型的蛋白质。
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酶工程简介
酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程 学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护 等方面的一门科学技术。由酶制剂的生产和应用两方 面组成的。 酶工程通常是用工程菌生产酶制剂，重点在于对已存 酶的合理充分利用。 蛋白质工程的重点那么在于对已存在的蛋白质分子的 改造。 随着蛋白质工程的开展，其成果也会应用到酶工程中， 使酶工程成为蛋白质工程的一局部。
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5Hale Waihona Puke ..分割..6〔1〕 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？ 请把相应的碱基序列写出来。有多少种 16种
〔2〕 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或 改造目的基因〔DNA〕？
确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改 造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。
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推测氨基酸序列
依据是什么
依赖于什么工程
投入生产
相应的脱氧核苷酸序列（基因）
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讨论
讨论：某多肽链的一段氨基酸序列是： …—丙氨酸—色氨酸—赖氨酸—甲硫氨酸—苯 丙氨 酸—… 〔1〕 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？ 请把相应的碱基序列写出来。有多少种？
〔2〕 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或 改造目的基因〔DNA〕？