枳属砧木对柑橘黄龙病的抗性评价

２０１４年第５期　东南园艺　枳属砧木对柑橘黄龙病的抗性评价　林雄杰　胡菡青　王贤达　蔡子坚　范国成　（福建省农业科学院果树研究所，福建福州３５００１３）　

摘　要：柑橘砧木影响着柑橘品种多种园艺学与病理学性状，选育优良砧木是柑橘优质丰产的基础。本研究以　１３个枳属及其杂交种砧木为研究对象，分别嫁接黄龙病接穗后，通过观察症状表现及黄龙病菌浓度检测评估供试　砧木对黄龙病的抗性。结果表明供试的砧木品种嫁接病穗３个月后除ＬＴ５４、ＬＴ５２、飞龙枳和枳柚外上均表现出了　黄龙病症状，嫁接６个月后所有供试砧木品种均表现出黄龙病症状。黄龙病菌浓度检测结果显示，嫁接３个月后　除了８株砧木外结果均为阳性，嫁接后６个月所有砧木检测结果均为阳性，供试接穗嫁接前和嫁接６个月后的病　菌平均浓度相当。本研究结果表明供试的砧木品种均不抗黄龙病，为抗柑橘黄龙病砧木的进一步筛选奠定了良好　基础。　关键词：枳属；黄龙病；砧木；抗性评价　

Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｎｃｉｒｕｓ　Ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ　ｏｎ　Ｈｕａｎｇｌ０ｎｇｂｉｎｇ　ＬＩＮ　Ｘｉｏｎｇ￣ｉｅ　ＨＵ　Ｈａｎ－ｑｉｎｇ　ＷＡＮＧ　Ｘｉａｎ—ｄａ　ＣＡＩ　Ｚｉ－ｊｉａｎ　ＦＡＮ　Ｇｕｏ—ｃｈｅｎｇ　（Ｆｒｕｉｔ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｕｊｉａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｚｈｏｕ。３５００１３，Ｆｕｊｉａｎ　Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｉｔｒｕｓ　ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ　ａｆｆｅｃｔ　ｍａｎｙ　ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｔｒａｉｔｓ　ｏｆ　ｃｉｔｒｕｓ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ．Ｉｔ　ｉｓ　ａ　ｇｏｏｄ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｈｉｇｈ　ｙｉｅｌｄ　ａｎｄ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｃｉｔｒｕｓ　ｗｉｔｈ　ｇｏｏｄ　ｓｔｏｃｋ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，１　３　Ｐｏｎｃｉｒｕｓ　ｔｒｉｆｏｌｉａｔｅ　ｏｒ　ｈｙｂｒｉｄ　ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｗｉｔｈ　ｓｃｉｏｎｓ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｎｃｉｒｕｓ　ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ　ｏｎ　Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ　ｗａｓ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｂｙ　ｓｙｍｐｔｏｍｓ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｌａｓ　ｔｉｔｅｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ａｌｌ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ　ｈａｄ　ｓｈｏｗｎ　ｓｙｍｐｔｏｍ　ｏｆ　Ｈｕａｎｇｌｏｎｂｉｎｇ　ｅｘｃｅｐｔ　ＬＴ５４，ＬＴ５２，Ｆｌｙｉｎｇ　Ｄｒａｇｏｎ　Ｔｒｉｆｏｌｉａｔｅ　ａｎｄ　ｃｉｔｒｕｍｅｌｏ　３　ｍｏｎｔｈｓ　ａｆｔｅｒ　ｇｒａｆｔｉｎｇ．Ａｌｌ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｓｙｍｐｔｏｍ　ｏｆ　Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ　６　ｍｏｎｔｈｓ　ａｆｔｅｒ　ｇｒａｆｔｉｎｇ．Ａｌｌ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ　ｗｅｒｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｅｘｃｅｐｔ　８　ｐｌａｎｔｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｌａｓ　ｔｉｔｅｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　３　ｍｏｎｔｈｓ　ａｆｔｅｒ　ｇｒａｆｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　６　ｍｏｎｔｈｓ　ａｆｔｅｒ　ｇｒａｆｔｉｎｇ．Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｏｆ　Ｌａｓ　ｔｉｔｅｒ　Ｏｎ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｓｃｉｏｎｓ　ｗａｓ　ａｌｍｏｓｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｂｅｆｏｒｅ　ｇｒａｆｔｉｎｇ　ａｎｄ　６　ｍｏｎｔｈｓ　ａｆｔｅｒ　ｇｒａｆｔｉｎｇ．Ａｌｌ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ　ｗｅｒｅ　ｎｏｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｔｏ　Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ．Ｉｔ　ｌａｉｄ　ａ　ｇｏｏｄ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ　ｗｉｔｈ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔｅ　ｔｏ　Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ　ｆｕｒｔｈｅｆｌｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｏｎｃｉｒｕｓ；Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ；Ｒｏｏｔｓｔｏｃｋ；Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｅｖａｌｕｔｉｏｎ；　

柑橘是世界第一大水果，它广泛分布在全球热　带、亚热带以及温带地区，现已有中国、美国、巴　西等１３８个国家（地区）在种植，总产量１．２４亿　吨［１－２］。据统计，柑橘及其加工产品年贸易额达　２３２亿美元，是仅次于小麦和玉米的第三大国际贸　易农产品ｌ　３】。柑橘砧木是嫁接栽培的基础，它直接　影响着接穗的园艺和病理学性状　。世界各柑橘生　产国因主栽品种和环境条件的不同选择的砧木也各　不相同。如美国柑橘的常用砧木为卡里佐枳橙、施　文格枳柚和特洛亚枳橙等；墨西哥和意大利以酸橙　为主要砧木；巴西的主要砧木为兰卜莱蒙；印度的　主要砧木为粗柠檬；我国虽然柑橘种质资源极为丰　富，但开展柑橘砧木资源选育研究比较晚，目前常　用的柑橘砧木为枳壳和红橘，其中枳壳的应用范围　

收稿目期：２０１４—０９—０６　基金项目：农业部公益性行业（农业）科研专项（２０１００３０６７—０５１；福建省农业科学院博士科研启动基金项目（２０１１ＢＳ—１）；福建省自然科学基　金项目（２０１２Ｊ０１　１０６）　作者简介：林雄杰（１９７９一），男，博士，助理研究员，从事分子植物病理学相关研究　通讯作者：范国成（１９６７一），男，博士，副研究员，从事植物病理及分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｕｏｅｈｅｎｇｆａｎ＠１２６．ｅｏｍ　２　东南园艺　２０１４年第５期　最广Ｌ　５ｌ。各地区根据当地方条件和特色不同，所选　用的砧木也存在一定的差异性。　柑橘黄龙病（Ｃｉｔｒｕｓ　Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ，ＨＬＢ）　自２０世纪初在华南地区首次报道以来［６１已有近百　年的历史，现已在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和　北美洲的近５０个国家和地区广泛分布　，它主要　通过柑橘木虱、带菌苗木和接穗进行传播＿８Ｊ，截至　目前尚无抗病品种和防治特效药，主要以防治柑橘　木虱和防止病原菌入侵作为该病害的防控手段。本　研究主要以中国柑橘研究所收集的简阳枳柚、墨西　哥枳橙、厚皮枳等ｌ３种枳属及其杂交种作为柑橘　砧木材料，分别嫁接芦柑病穗，通过对嫁接３个月　和６个月后砧木及接穗上黄龙病菌含量测定，以明　确供试砧木对黄龙病抗性差异，从而为抗柑橘黄龙　病砧木的进一步筛选提供理论依据。　ｌ材料与方法　１．１供试材料　本研究供试的砧木材料为福建省农科院果树研　究所从中国柑橘研究所引进的ＬＴ４９、５号小花枳、　墨西哥枳橙、ＬＴ５４、飞龙枳、卡里佐枳橙、鄢陵枳　橙、腊斯克（ｒｕｓｋ）枳橙、枳柚、薄皮枳、ＬＴ５２、　ＬＴ５３和小院枳柚等ｌ３个枳属其杂交种（表ｉ）。　按每个品种ｌ０株将这些砧木分别定植于试验园中　备用。　供试接穗为２０１３年９月从顺昌县和建瓯市采　集的具有典型黄龙病症状，经定量ＰＣＲ检测结果　为阳性的芦柑接穗，采回后塑料膜包好放置４℃冰　箱备用。　１．２病穗嫁接　将供试接穗剪成ｌ５～２０　ｃｍ（包含３～４个芽）　长的小段，参照柑橘常用的嫁接方法（切接法）［９１，　每株砧木在距离地面１０　ｅｍ以上的地方选两个枝干　分别嫁接１个接穗，然后用塑料条将整个接穗和砧　木的伤口包扎好，接穗需封顶戴帽，每个砧木品种　嫁接ｌ０株，嫁接后保持正常肥水管理，供进一步　试验。　１．３症状评价、样品采集及ＤＮＡ提取　嫁接后的３个月和６个月分别调查１次接穗及　砧木上新梢黄龙病症状，每次调查５张叶片，根据　叶片黄化或斑驳的面积占整张叶片的比例（Ｓ１）　将其分为４个等级：无症状为１级；０≤ＳＩ≤１／３　为２级；１／３≤ＳＩ≤２为３级；２／３≤ＳＩ为４级。　调查完后随机采集３～４片完全展开的叶片，用自来　水洗净后自然风干，剪取其的叶片中脉，并剪成　１～２　ｍｍ的小段，冷冻干燥后，用研磨仪（ＭＭ４００）　将其磨碎，参照Ｍｕｒｒａｙ　等的方法提取ＤＮＡ。用　微量紫外分光光度计（ＮＡＮＯＤＲＯＰ　２　０００Ｃ）测量各　样品ＤＮＡ浓度，并将其浓度调到５０　ｎｇ・ｕｌ～，置　于一２８ｏＣ冰箱备用。　

表１供试砧木品种及来源　２０１４年第５期　东南园艺　３　１．４病菌含量定量ＰＣＲ检测　引物和探针序列参照Ｌｉ等【ｌ１】，由大连宝生物　（Ｔａｋａｒａ）有限公司合成。ＰＣＲ反应体系为２０¨ｌ，　其中Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　１０　ｌ，２５０ｎＭ的引物各１　ｌ，　１５０　ｎＭ探针１　ｌ，样品ＤＮＡ　１　１，无菌双蒸水　６　１。反应在Ｂｉｏ—ｒａｄ　ＣＦＸ９６ＴＭ上进行，扩增程序　如下：９５℃预变性２　ｍｉｎ，９５℃１０　ｓ，５８℃３０　Ｓ，　４０个循环。　１．５数据分析　砧木及接穗嫁接前后的病情指数及叶片病菌浓　度差异用ＤＰＳ　ｖ７．０５软件的单因素试验统计方法分　析，先分别计算出嫁接前后砧木及接穗的病情指数　和叶片的病菌浓度，再分别比较它们之间的差异。　２结果与分析　２．１症状调查结果　砧木嫁接病穗后３个月统计结果表明嫁接的成　活率平均在７０％以上。嫁接后３个月和６个月对砧　木和接穗的症状调查统计结果如表２所示。由表２　可知，供试的１３个砧木品种嫁接病穗后３个月除　ＬＴ５４、ＬＴ５２、飞龙枳和枳柚４个品种外，其余的砧　木上均表现出了黄龙病状（ＳＩ＞０），所有供试品种的　接穗上均可见典型的黄龙病症状；嫁接后６个月所　有供试砧木品种均表现出黄龙病症状，而ＬＴ４９、５　号小花枳、墨西哥枳橙、ＬＴ５４和鄢陵枳橙等５个　品种接穗上的黄龙病症状最为严重，病情指数为　１．００。嫁接后６个月无论是砧木还是接穗上的症状　都有明显加重的趋势，它们的病情指数与嫁接后３　个月的差异均为极显著（ｐ＜０．０１）（表３）。　

表２砧木及接穗病Ｉ晴指数　

注：病情指数：∑（各级病叶数×各级代表值）／（调查总叶数×最高级代表值）。　表３砧木及接穗病Ｉ情指数方差分析