常见琼脂糖凝胶电泳错误

Example 1“Smearing”，导致拖尾效应有很多的原因，最终要的是丙烯酰胺灌制的不够均匀和样品量过大！这是当时学生制胶时底下已经凝固，然后再重新补上一部分的浓缩胶和分离胶所致！当然重叠在一起，无法区分也是难免了。

Example 2样品量过大而出现了样品“交叉”污染，正常的当载样在20 to 40 micrograms/well 将会很漂亮。

Example 3样品量过大，当然胶灌制的也不够均匀。

由于过量的样品影响了个别泳道的电场，使的有些条带宽，有的窄些。

Example 4“Smearing”（注意泳道4），这可能和样品中的含有大量脂类的膜相关蛋白引起的：由于不连续的胶中，样品被浓缩的很厉害。

所有样的迁移速率在样品过积层胶后都会慢下来，当到达分离胶时，PH的改变使得聚集的膜相关蛋白有沉降的倾向，但另一个方面，电泳过程又不断的溶解这些蛋白，因此便出现了泳道4中连续的黑色托尾，通过WESTERN验证后，这些都是一个组分造成的！Example 5这张还不是太糟糕。

泳道4还加上飞纹，原因是样品未能处理好，上样量控制的也不够好，另外跑的过程可能电压过大；另外这张胶当时做的时候，分离胶凝固的并不是很好，蛋白穿过胶孔时，浓度并不均一，因此形成了飞纹而不是一片黑色托尾。

由于样品跑的比较直且齐整，因此电场还是比较均匀的。

泳道5中的蛋白没有很好的溶解。

Example 6简直一塌糊涂！首先做好分离胶时，没有封闭。

另外，样品很快的沉降到不平整的脚面上，随着电泳的进行，样品不断的融解，以至形成托尾而不是一条条清洗的条带。

另外，这个样品可能含有杂质比较多（不溶性杂质或基因组DNA），可见上样前的充分离心也是必要的!Example 7条带太淡。

背景脏且不够均匀，说明电泳缓冲液有污染（杂质在电泳过程中不断的进入胶中），或者板子没有洗干净。

在溴芬兰线的后面还有连续的细线，说明上样不够小心，致使样品飞了出孔，同时也污染了其他的相临样品。

琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程凝胶电泳操作注意事项：1. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA 变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。

长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。

2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。

3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。

倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。

4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。

5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。

6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。

7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。

采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。

小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。

琼脂糖加样时候注意事项：1、用移液抢将样品加至点样孔。

每孔点样的体积一般少于25ul，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。

2、常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。

3、在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝），用以看出样品移动的距离。

4、在一个或几个孔中加入标准分子质量样品，电泳结束后，根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。

5、电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。

注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。

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3． SDS 样品中产生聚集物 单向 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品通常须在 1-2 % SDS 和 1 %（w/v）DTT（≈65 mM）或 2 %（v/v）β-巯基 乙醇（≈350 mM）存在时煮沸几分钟，以实现多肽链的彻底变性和解折叠。 错误 样品常常在冷却后直接上样到 SDS 凝胶中。通常还原剂被部分氧化，其中一部分半胱氨酸不受保护，导致重折叠和 多肽间聚集物的形成。重折叠形成模糊的区带，有时是两条带。一些聚集物在高分子量区域形成了人为的区带；其 他聚集物则过大，无法迚入凝胶，在点样孔形成了沉淀聚集。还原剂的过量可能在整个凝胶上 40-60 kDa 的分子量 范围内形成两条或三条水平线。 正确的操作 煮沸后让样品冷却至 60°C 左右，然后加入碘乙酰胺。通常我们在 100 μl 样品中加入 10 μl 20%（w/v）的碘乙 酰胺水溶液，并在室温下孵育 30 分钟。 通过这一步，我们可以获得更为锐利的条带，并排除了一些假象，如两条带、其他的高分子量条带、点样孔中的沉 淀，以及凝胶上的线。 4． SDS 电泳中运行缓冲液的滴定 到目前为止，大部分单向和双向 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用是在基于 Lämmli 的不连续缓冲液系统中开展的[1]。 其他基于磷酸盐、咪唑或其他缓冲液的均一系统表现出的分辨率和重复性不高。在不连续的“Lämmli”系统中，积 层胶和分离胶缓冲液是由指定 pH 值的 Tris 和氯离子缓冲液组成的 – 其中含有或不含 SDS，运行缓冲液中则包含 SDS、Tris 和甘氨酸。氯离子作为前导离子和甘氨酸作为尾随离子之间的不连续性控制蛋白缓慢迚入聚丙烯酰胺凝 胶，并实现积层效应，产生非常锐利和清晰可辨的区带。 错误 不幸的是，有一些操作步骤建议将 Tris-甘氨酸缓冲液的 pH 调整至 pH 8.3-8.4。这导致上层缓冲液槽中的氯离子载 量过高，产生下列影响：分离将比预期时间要长得多，且一些区带不好分辨。因氯离子相对其他所有离子有着非常 高的电泳迁移率，所以只有氯离子向阳极方向迁移，直到上层缓冲液槽中没有任何的氯离子剩余。到那时蛋白离子 才会开始迁移。在大型的电泳槽中，这需要几个小时至过夜。此外，积层效果也不如理想的不连续缓冲液那样好。 正确的操作 只使用 Tris 碱、甘氨酸和 SDS 作为运行缓冲液。请勿滴定缓冲液，即使它的 pH 高于 9。使用高质量的试剂。

DNA琼脂糖凝胶电泳跑胶即走电泳，是DNA 和protein 最基本的定性定量方法。

一般是琼脂糖胶或page 胶，琼脂糖胶一般是检测DNA的，可以检验一下你到底提到dna没过确定你提dna分子量的大小：page胶一般是检测蛋白特性的，通过page胶里marker的分子量大小来确定你需要的目的蛋白分子量大小，如果有杂带那就可以判断那条带是你需要的目的条带，如果想知道蛋白浓度，还可以在page胶里带上一条定量marker，通过条带粗细，来判断你需要蛋白的浓度。

二者原理一致，小分子量用大浓度的胶，大分子量用小浓度的胶，特别小的DNA 用丙烯酰胺凝胶。

一、基本原理当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。

F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。

由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。

此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。

当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。

根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。

该公式指球形颗粒所受的阻力。

代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。

带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：m＝μ/E=d*l/V*td为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。

在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。

它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。

影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。